中科院團隊利用WGBS揭示長壽男性特有的DNA甲基化修飾機制

男性通常比女性壽命短，但長壽男性（long-lived men，LLMs）往往表現(xiàn)出更好的健康狀態(tài)，包括良好的身體表現(xiàn)和較低的癌癥風險。這種現(xiàn)象表明男性可能存在一種特定的長壽策略。DNA甲基化作為一種表觀遺傳修飾，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著重要作用，并與衰老和年齡相關(guān)疾病密切相關(guān)。已有研究表明，DNA甲基化在人類長壽中發(fā)揮重要作用，且兩性之間存在甲基化模式差異，這可能與人類壽命的性別差異有關(guān)。因此，研究LLMs的DNA甲基化特征對于揭示男性長壽的生物學基礎(chǔ)具有重要意義。
 
近日，中國科學院昆明動物研究所孔慶鵬研究員團隊通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析了長壽男性（LLMs）的DNA甲基化特征，揭示了與男性長壽相關(guān)的特異性甲基化修飾模式。研究發(fā)現(xiàn)LLMs中存在3035個差異甲基化基因組單元（differentially methylated genomic units，DMUs），這些DMUs不依賴于年齡和性別，并且與健康相關(guān)的基因密切相關(guān)。這些DMUs可能通過調(diào)控基因表達來促進長壽和抑制與年齡相關(guān)的疾病，為男性健康衰老和長壽的表觀遺傳機制提供了新的見解。相關(guān)研究成果以“Methylome analysis in long-lived men deciphers DNA methylation modifications associated with male longevity in humans”為題發(fā)表于《Cell Reports》期刊。

標題：Methylome analysis in long-lived men deciphers DNA methylation modifications associated with male longevity in humans（長壽男性的甲基化組分析揭示了與人類男性長壽相關(guān)的DNA甲基化修飾）
發(fā)表時間：2025年1月7日
期刊：Cell Reports
影響因子：IF 7.5 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：WGBS
       本研究對長壽男性（LLMs）、長壽女性（long-lived women，LLWs）、年輕男性（younger men，YMs）和年輕女性（younger women，YWs）進行了全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）以分析LLMs中特定的甲基化特征。分析結(jié)果表明，盡管與LLWs相比，LLMs甲基化衰老速率加快，但WGBS鑒定出數(shù)千個不依賴于年齡和性別的LLMs差異甲基化基因組單元（DMUs）。這些DMUs通過彈性網(wǎng)絡分類器驗證，可以作為區(qū)分男性長壽潛力的甲基化標記。許多DMUs位于與健康相關(guān)基因附近，PIWIL1和EXT1等基因啟動子區(qū)域存在DMUs，這些基因通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄來抑制年齡相關(guān)疾病，體現(xiàn)了LLMs特異性甲基化模式的潛在作用。本研究結(jié)果為LLMs的健康衰老和長壽提供了獨特的甲基化特征證據(jù)。
亮點

• WGBS鑒定出3035個特定于長壽男性的差異甲基化基因組單元（DMUs）。
• DMUs優(yōu)先與衰老、年齡相關(guān)疾病和長壽相關(guān)的基因相關(guān)聯(lián)。
• DMUs有潛力成為長壽男性的特定甲基化特征標記。
• DMUs包含的CpG位點很少被甲基化芯片覆蓋。

研究摘要
研究方法
1.  樣本收集：研究者從中國海南地區(qū)收集了221名受試者的外周血樣本，包括76名長壽男性（LLMs，平均年齡97.0歲）、57名長壽女性（LLWs，平均年齡102.2歲）、32名年輕男性（YMs，平均年齡64.5歲）和56名年輕女性（YWs，平均年齡64.5歲）。
2.  全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）：對所有樣本進行WGBS，以單堿基分辨率分析其甲基化組。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴格的質(zhì)控和比對，最終獲得了34.5 Tbp的clean data，平均測序深度至少為30X。
3.  甲基化水平計算：計算每個CpG位點的甲基化水平，并校正批次效應，去除異常樣本。
4.  差異甲基化分析：基于注釋的非重疊連續(xù)基因組單元（genomic units），鑒定LLMs中獨特的差異甲基化單元（DMUs），并使用彈性網(wǎng)絡（elastic net）分類器驗證這些DMUs作為LLMs的甲基化標記的潛力。
5.  表觀遺傳年齡計算和無監(jiān)督聚類分析。
6.  功能富集分析：對DMUs的潛在目標基因進行功能富集分析，評估其與健康衰老和長壽的相關(guān)性。
研究結(jié)果
（1）LLM、LLW、YM 和 YW 的WGBS單堿基分辨率甲基化分析
圖1：長壽男性（LLMs）表現(xiàn)出與長壽女性（LLWs）相當?shù)募铀俦碛^遺傳衰老速率
A. 研究設計
B. LLMs、LLWs、YMs和YWs的平均自染色體甲基化水平
C. 基于Zhang’s clock（Zhang時鐘）的表觀遺傳時鐘加速度(epigenetic age acceleration，EAA）分析，分析結(jié)果顯示LLMs和LLWs的表觀遺傳衰老速率較YMs和YWs有所減緩，但LLMs相對于LLWs表現(xiàn)出顯著加速的表觀遺傳衰老速率。這表明盡管LLMs的表觀遺傳年齡增長更快，但仍能夠?qū)崿F(xiàn)長壽。
D. 基于Komaki’s clock（Komaki時鐘）的EAA分析，與Zhang時鐘的結(jié)果一致，Komaki時鐘也顯示LLMs的表觀遺傳衰老速率顯著高于LLWs，進一步驗證了LLMs特有的表觀遺傳特征。
 
（2）LLM表觀基因組中特有的甲基化模式

圖2：在自染色體上鑒定LLMs特異性差異甲基化單元（llm-DMUs）
A. DMUs維恩圖展示不同比較組（LLMs vs. LLWs、LLMs vs. YMs、LLMs vs. YWs，以及LLMs vs. 其他所有樣本）中鑒定出的DMUs數(shù)量。這些DMUs是LLMs中特有的甲基化特征。
B. 甲基化差異熱圖展示LLMs與其他樣本（LLWs、YMs和YWs）之間鑒定出的DMUs甲基化水平差異。顏色深淺表示甲基化水平高低，揭示LLMs中特有的甲基化模式。
C. 主成分分析（PCA）圖基于DMUs的甲基化水平，LLMs與其他樣本（LLWs、YMs和YWs）能夠被有效區(qū)分。這表明LLMs具有獨特的甲基化特征，使其在基因組水平上與其他群體分離。
D. llm-DMUs在不同基因組區(qū)域的分布，包括啟動子區(qū)域、基因體區(qū)域和基因間區(qū)域。結(jié)果顯示，LLMs的DMUs主要分布在基因體和基因間區(qū)域，這可能與基因表達調(diào)控有關(guān)。
E. llm-DMUs傾向于覆蓋較少的CpG位點。這意味著LLMs中的一些甲基化特征可能由單個或少數(shù)幾個CpG位點的甲基化變化驅(qū)動，而不是由大片段的甲基化變化引起。
F. llm-DMUs傾向于表現(xiàn)出中等甲基化水平（25%–75%）。表明LLMs中的甲基化變化可能不是完全的高甲基化或低甲基化，而是處于中間狀態(tài)，這可能對基因表達調(diào)控具有重要意義。
G. llm-DMUs在特定的染色質(zhì)狀態(tài)中顯著富集，包括1_TssA（活躍轉(zhuǎn)錄起始位點）、4_Tx（強轉(zhuǎn)錄區(qū)域）和8_ZNF/Rpts（鋅指蛋白基因和重復序列）。這些區(qū)域通常與基因表達調(diào)控密切相關(guān)，表明LLMs中的甲基化特征可能在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。
其他樣本：指合并的LLWs、YMs和YWs樣本。背景：指所有自染色體上的基因組單元。LM：低甲基化（<25%）。IM：中等甲基化（25%–75%）。HM：高甲基化（>75%）。E062：外周血單核細胞。
 
（3）Llm-DMU有可能成為LLM鑒別的甲基化標記
圖3：llm-DMUs作為潛在甲基化標記的鑒定與評估
A. 在彈性網(wǎng)絡分類器中，每個llm-DMU特征的系數(shù)值。系數(shù)值的大小反映了該特征在分類模型中的重要性。正值表示該特征傾向于將樣本分類為LLMs，負值則相反。圖中顯示了43個最具信息量的llm-DMUs，其中13個為高甲基化（hypermethylated）DMUs，30個為低甲基化（hypomethylated）DMUs。
B. 接收者操作特征（ROC）曲線和曲線下面積（AUC）評分展示了通過訓練的EN分類器在測試數(shù)據(jù)集中對LLMs與其他樣本進行分類的性能。ROC曲線是通過繪制真正例率（True Positive Rate, TPR）與假正例率（False Positive Rate, FPR）得到的，AUC值為0.86，表明該分類器具有較高的區(qū)分能力，能夠較好地區(qū)分LLMs與其他樣本。
C. 混淆矩陣（Confusion Matrix）展示了分類器在測試數(shù)據(jù)集中對LLMs與其他樣本（LLWs、YMs和YWs）的分類效率。圖中顯示，分類器準確鑒定出77.27%的LLMs和87.80%的其他樣本，表明這些llm-DMUs在區(qū)分LLMs方面具有較高的準確性。
D. 展示了在LLMs與其他樣本之間，排名前5的llm-DMUs的甲基化水平差異。箱線圖（boxplot）呈現(xiàn)了這些DMUs的甲基化水平分布，其中每個DMU的甲基化水平在LLMs與其他樣本之間存在顯著差異。這些差異表明這些llm-DMUs可以作為潛在的甲基化標記，用于區(qū)分LLMs。
 

（4）Llm-DMU 優(yōu)先位于與長壽和衰老相關(guān)疾病相關(guān)的基因區(qū)域
圖 4 llm-DMU 對人類健康衰老和長壽的生物學意義
A. 對llm-DMUs的潛在目標基因進行了KEGG通路富集分析，以了解這些基因在生物通路中的功能聚集情況。
B. 通過超幾何檢驗，分析了llm-DMUs的潛在靶基因在與人類健康相關(guān)的不同基因集中的富集程度。箱線圖展示了這些基因集的分布情況，其中****表示p<0.01，*****表示p<0.001，表明這些基因與健康衰老和長壽密切相關(guān)。
C. 利用分層連鎖不平衡分數(shù)回歸（S-LDSC）分析了llm-DMUs的潛在目標基因在不同性狀中的遺傳力富集情況，以評估這些基因在遺傳性狀中的作用。
D. 兩個示例：展示了兩個具有代表性的基因——PIWIL1（一個腫瘤促進基因，其啟動子區(qū)域在LLMs中存在兩個高甲基化的DMUs）和EXT1（一個腫瘤抑制基因，其啟動子區(qū)域在LLMs中存在一個低甲基化的DMU）。
小結(jié)
LLMs具有獨特的DNA甲基化特征，這些特征可能通過調(diào)控基因表達來促進長壽和抑制與年齡相關(guān)的疾病。這些甲基化特征可以作為潛在的標記，用于預測男性的長壽潛力，并可能為開發(fā)健康風險評估工具和干預措施提供新的方向。
待解決問題
1.      健康評估數(shù)據(jù)不足：由于樣本收集的限制，缺乏詳細的健康評估數(shù)據(jù)，無法進一步驗證LLMs的健康狀態(tài)。
2.      多組學數(shù)據(jù)整合：需要整合基因表達、染色質(zhì)狀態(tài)等多組學數(shù)據(jù)，以全面理解這些甲基化模式的調(diào)控功能。
3.      調(diào)控機制的驗證：需要進一步的實驗來驗證這些甲基化模式的調(diào)控機制，并確認其在健康衰老和長壽中的具體作用。
WGBS在本研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用
1.      單堿基分辨率甲基化分析：WGBS提供了單堿基分辨率的甲基化數(shù)據(jù)，使得研究者能夠精確鑒定LLMs中特有的甲基化特征。
2.      全面覆蓋基因組：WGBS覆蓋全基因組的CpG位點，包括那些傳統(tǒng)甲基化芯片無法覆蓋的區(qū)域，從而揭示更多潛在的長壽相關(guān)甲基化位點。
3.      不依賴于年齡和性別的分析：通過WGBS數(shù)據(jù)，研究者能夠鑒定出不依賴于年齡和性別的差異甲基化單元（DMUs），為研究LLMs的獨特甲基化特征提供基礎(chǔ)。
易基因：DNA甲基化研究基本思路
DNA甲基化一般遵循四個步驟：
首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關(guān)性分析等。
其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結(jié)合分析、時序甲基化數(shù)據(jù)的分析策略、DMG的功能分析等。
再次，將甲基化組學&轉(zhuǎn)錄組學關(guān)聯(lián)分析，包括Meta genes整體關(guān)聯(lián)、DMG-DEG對應關(guān)聯(lián)、網(wǎng)絡關(guān)聯(lián)等。
最后，對篩選出的目標區(qū)域DNA甲基化進行驗證，通常采用靶基因重亞硫酸鹽測序（Target-BS）。

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參考文獻：
Xiao FH, Wang HT, Zhao L, Xia TR, Yang LQ, Ma SY, Kong QP. Methylome analysis in long-lived men deciphers DNA methylation modifications associated with male longevity in humans. Cell Rep. 2025 Jan 7;44(1):115158. pii: S2211-1247(24)01509-2. doi: 10.1016/j.celrep.2024.115158.