膜片鉗記錄和分析技術介紹
膜片鉗技術原理及應用
細胞是動物和人體的基本組成單元，細胞與細胞內的通信,是依靠其膜上的離子通道進行的，離子和離子通道是細胞興奮的基礎，亦即產生生物電信號的基礎，生物電信號通常用電學或電子學方法進行測量。由此形成了一門細胞學科—電生理學（electrophysiology），即是用電生理的方法來記錄和分析細胞產生電的大小和規(guī)律的科學。
早期的研究多使用雙電極電壓鉗技術作細胞內電活動的記錄�，F(xiàn)代膜片鉗技術是在電壓鉗技術的基礎上發(fā)展起來的。
1976年德國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann創(chuàng)建了膜片鉗技術（patch clamp recording technique）。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的（或多個的離子通道分子活動的技術）。以后由于吉歐姆阻抗封接(gigaohm seal, 109Ω)方法的確立和幾種方法的創(chuàng)建。這種技術點燃了細胞和分子水平的生理學研究的革命之火，它和基因克隆技術（gene cloning）并架齊驅，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。
這一偉大的貢獻，使Neher和Sakmann獲得1991年度的諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。
早期的研究多使用雙電極電壓鉗技術作細胞內電活動的記錄�，F(xiàn)代膜片鉗技術是在電壓鉗技術的基礎上發(fā)展起來的。
1976年德國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann創(chuàng)建了膜片鉗技術（patch clamp recording technique）。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的（或多個的離子通道分子活動的技術）。以后由于吉歐姆阻抗封接(gigaohm seal, 109Ω)方法的確立和幾種方法的創(chuàng)建。這種技術點燃了細胞和分子水平的生理學研究的革命之火，它和基因克隆技術（gene cloning）并架齊驅，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。
這一偉大的貢獻，使Neher和Sakmann獲得1991年度的諾貝爾生理學與醫(yī)學獎。
一、膜片鉗技術發(fā)展歷史
1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而產生了膜片鉗技術。
1980年Sigworth等在記錄電極內施加5-50 cmH2O的負壓吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了記錄時的噪聲實現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。
1981年Hamill和Neher等對該技術進行了改進，引進了膜片游離技術和全細胞記錄技術，從而使該技術更趨完善，具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時間分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording》一書問世，奠定了膜片鉗技術的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。
1976年德國馬普生物物理化學研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而產生了膜片鉗技術。
1980年Sigworth等在記錄電極內施加5-50 cmH2O的負壓吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了記錄時的噪聲實現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。
1981年Hamill和Neher等對該技術進行了改進，引進了膜片游離技術和全細胞記錄技術，從而使該技術更趨完善，具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時間分辨率。
1983年10月，《Single-Channel Recording》一書問世，奠定了膜片鉗技術的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。
二：膜片鉗技術原理
膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來（見右圖），由于電極尖端與細胞膜的高阻封接，在電極尖端籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離，因此，此片膜內開放所產生的電流流進玻璃吸管，用一個極為敏感的電流監(jiān)視器（膜片鉗放大器）測量此電流強度，就代表單一離子通道電流。
膜片鉗技術的建立，對生物學科學特別是神經科學是一資有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的（或多個的離子通道分子活動的技術。些技術的出現(xiàn)自然將細胞水平和分子水平的生理學研究聯(lián)系在一起，同時又將神經科學的不同分野必然地融匯在一起，改變了既往各個分野互不聯(lián)系、互不滲透，阻礙人們全面認識能力的弊端。
這一技術的發(fā)現(xiàn)和基因克隆技術并架齊驅，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。
膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來（見右圖），由于電極尖端與細胞膜的高阻封接，在電極尖端籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離，因此，此片膜內開放所產生的電流流進玻璃吸管，用一個極為敏感的電流監(jiān)視器（膜片鉗放大器）測量此電流強度，就代表單一離子通道電流。
膜片鉗技術的建立，對生物學科學特別是神經科學是一資有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的（或多個的離子通道分子活動的技術。些技術的出現(xiàn)自然將細胞水平和分子水平的生理學研究聯(lián)系在一起，同時又將神經科學的不同分野必然地融匯在一起，改變了既往各個分野互不聯(lián)系、互不滲透，阻礙人們全面認識能力的弊端。
這一技術的發(fā)現(xiàn)和基因克隆技術并架齊驅，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。
三：全自動膜片鉗技術
膜片鉗技術被稱為研究離子通道的“金標準”。是研究離子通道的最重要的技術。目前膜片鉗技術已從常規(guī)膜片鉗技術（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術（Automated patch clamp technique）。
傳統(tǒng)膜片鉗技術每次只能記錄一個細胞（或一對細胞），對實驗人員來說是一項耗時耗力的工作，它不適合在藥物開發(fā)初期和中期進行大量化合物的篩選，也不適合需要記錄大量細胞的基礎實驗研究。全自動膜片鉗技術的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題，它不僅通量高，一次能記錄幾個甚至幾十個細胞，而且從找細胞、形成封接、破膜等整個實驗操作實現(xiàn)了自動化，免除了這些操作的復雜與困難。這兩個優(yōu)點使得膜片鉗技術的工作效率大大提高了！簽于全自動膜片鉗技術的這些優(yōu)點，目前已經廣泛的用于藥物篩選。
四：膜片鉗技術的應用
1. 應用學科
膜片鉗技術發(fā)展至今，已經成為現(xiàn)代細胞電生理的常規(guī)方法，它不僅可以作為基礎生物醫(yī)學研究的工具，而且直接或間接為臨床醫(yī)學研究服務，
目前膜片鉗技術廣泛應用于神經（腦）科學、心血管科學、藥理學、細胞生物學、病理生理學、中醫(yī)藥學、植物細胞生理學、運動生理等多學科領域研究。
隨著全自動膜片鉗技術（Automatic patch clamp technology）的出現(xiàn)，膜片鉗技術因其具有的自動化、高通量特性，在藥物研發(fā)、藥物篩選中顯示了強勁的生命力。
2. 應用的標本種類
使用的標本種類繁多。從最早的肌細胞（心肌、平滑肌、骨骼�。�、神經元和內分泌細胞發(fā)展到血細胞、肝細胞、耳窩毛細胞、胃壁細胞、上皮細胞、內皮細胞、免疫細胞、精母細胞等多種細胞；從急性分散細胞和培養(yǎng)細胞（包括細胞株）發(fā)展到組織片（如腦片、脊髓片）乃至整體動物；從蝸牛、青蛙、蠑螈、爪蟾卵母細胞發(fā)展到雞細胞、大鼠細胞、人細胞等等；從動物細胞發(fā)展到細菌、真菌以及植物細胞。此外，膜片鉗技術還廣泛地應用到平面雙分子層（Planar bilayer）、脂質體（Liposome）等人工標本上。
3. 研究對象
研究對象已經不局限于離子通道。從對離子通道（配體門控性、電壓門控性、第二信使介導的離子通道、機械敏感性離子通道以及縫隙連接通道等等）的研究發(fā)展到對離子泵、交換體以及可興奮細胞的胞吞、胞吐機制的研究等。
4. 應用舉例：
(1). 膜片鉗技術在通道研究中的重要作用
應用膜片鉗技術可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時可發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型，并能在記錄單細胞電流和全細胞電流的基礎上進一步計算出細胞膜上的通道數和開放概率，還可以用以研究某些胞內或胞外物質對離子通道開閉及通道電流的影響等。同時用于研究細胞信號的跨膜轉導和細胞分泌機制。結合分子克隆和定點突變技術，膜片鉗技術可用于離子通道分子結構與生物學功能關系的研究。
利用膜片鉗技術還可以用于藥物在其靶受體上作用位點的分析。如神經元煙堿受體為配體門控性離子通道，膜片鉗全細胞記錄技術通過記錄煙堿誘發(fā)電流，可直觀地反映出神經元煙堿受體活動的全過程，包括受體與其激動劑和拮抗劑的親和力，離子通道開放、關閉的動力學特征及受體的失敏等活動。使用膜片鉗全細胞記錄技術觀察拮抗劑對煙堿受體激動劑量效曲線的影響，來確定其作用的動力學特征。然后根據分析拮抗劑對受體失敏的影響，拮抗劑的作用是否有電壓依賴性、使用依賴性等特點，可從功能上區(qū)分拮抗劑在煙堿受體上的不同作用位點，即判斷拮抗劑是作用在受體的激動劑識別位點，離子通道抑或是其它的變構位點上。
(2).與藥物作用有關的心肌離子通道
心肌細胞通過各種離子通道對膜電位和動作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能。近年來，國外學者在人類心肌細胞離子通道特性的研究中取得了許多進展，使得心肌藥理學實驗由動物細胞模型向人心肌細胞成為可能。
(3).對離子通道生理與病理情況下作用機制的研究
通過對各種生理或病理情況下細胞膜某種離子通道特性的研究，了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機制。如對鈣離子在腦缺血神經細胞損害中作用機制的研究表明，缺血性腦損害過程中，Ca2+ 介導現(xiàn)象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道開放，過多的Ca2+進入細胞內就出現(xiàn)Ca2+超載，導致神經元及細胞膜損害，膜轉運功能障礙，嚴重的可使神經元壞死
(4).對單細胞形態(tài)與功能關系的研究
將膜片鉗技術與單細胞逆轉錄多聚酶鏈是反應技術結合，在全細胞膜片鉗記錄下，將單細胞內容物或整個細胞（包括細胞膜）吸入電極中，將細胞內存在的各種mRNA全部快速逆轉錄成cDNA，再經常規(guī)PCR擴增及待檢的特異mRNA的檢測，借此可對形態(tài)相似而電活動不同的結果做出分子水平的解釋或為單細胞逆轉錄多聚酶鏈式反應提供標本，為同一結構中形態(tài)非常相似但功能不同的事實提供分子水平的解釋。目前國際上掌握此技術的實驗室較少，我國北京大學神經科學研究所于1994年在國內率先開展。
(5).對藥物作用機制的研究
在通道電流記錄中，可分別于不同時間、不同部位（膜內或膜外）施加各種濃度的藥物，研究它們對通道功能的可能影響，了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動物生理功能的分子機理。這是目前膜片鉗技術應用最廣泛的領域，既有對西藥藥物機制的探討，也廣泛用在重要藥理的研究上。如開麗等報道細胞貼附式膜片鉗單通道記錄法觀測到人參二醇組皂苷可抑制正常和“缺血”誘導的大鼠大腦皮層神經元L-型鈣通道的開放，從而減少鈣內流，對缺血細胞可能有保護作用。陳龍等報道采用細胞貼附式單通道記錄法發(fā)現(xiàn)烏頭堿對培養(yǎng)的Wistar大鼠心室肌細胞L-型鈣通道有阻滯作用。
(6). 在心血管藥理研究中的應用
隨著膜片鉗技術在心血管方面的廣泛應用，對血管疾病和藥物作用的認識不僅得到了不斷更新，而且在其病因學與藥理學方面還形成了許多新的觀點。正如諾貝爾基金會在頒獎時所說：“Neher和Sadmann的貢獻有利于了解不同疾病機理，為研制新的更為特效的藥物開辟了道路”。
(7). 創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選
目前在離子通道高通量篩選中主要是進行樣品量大、篩選速度占優(yōu)勢、信息量要求不太高的初級篩選。最近幾年，分別形成了以膜片鉗和熒光探針為基礎的兩大主流技術市場。將電生理研究信息量大、靈敏度高等特點與自動化、微量化技術相結合，產生了自動化膜片鉗等一些新技術。
五：廠家介紹
膜片鉗技術的核心部分是膜片鉗放大器系統(tǒng)，包括：膜片鉗放大器（Amplifier）、數模/模數轉換器（Digitizer）和數據采樣和分析軟件（Software）三個部分，共同完成離子通道電流的采集、處理和分析。由于離子通道電流的大小通常是在pA到nA范圍內，要記錄如此微弱的通道電流信號，就需要特殊電路設計的膜片鉗放大器和高精度、低噪聲的數模/模數轉換器。
在膜片放大器系統(tǒng)領域，美國MDC公司生產的AXON系列膜片鉗放大器系統(tǒng)占有主導地位，無論從產品的技術含量還是從產品的應用領域上來看，在膜片鉗技術中始終處于領先的地位，代表著膜片鉗技術發(fā)展的方向，是國內外膜片鉗實驗室首選實驗儀器，這可以從下面幾個方面得到體現(xiàn)：
1. 專業(yè)的生產廠家
AXON是最早生產膜片鉗放大器的廠家，從早期的1D到200A，200B，700A，700B等傳統(tǒng)膜片鉗放大器，到今天的全自動膜片鉗系統(tǒng)的開發(fā)和應用，始終引領著膜片鉗技術的發(fā)展方向。其pClamp10記錄分析軟件是一款功能全面強大的軟件，可以滿足膜片鉗和電生理所有的需要。系列的膜片鉗放大器系統(tǒng)被認為是膜片鉗技術應用的標準系統(tǒng)。
2. 產品種類齊全
AXON系列膜片鉗放大器系統(tǒng)不僅能夠滿足傳統(tǒng)的膜片鉗研究中所有需要，在全自動膜片鉗技術上更是處于世界領先地位，在高通量藥物篩選中得到廣泛的應用。作為一家專業(yè)生產電生理膜片鉗儀器的著名廠家，其產品覆蓋了膜片鉗技術上所需的所有放大器種類，產品豐富，種類齊全。
3. 應用廣泛
AXON既有應用于傳統(tǒng)的膜片鉗技術的放大器系統(tǒng)，也有應用于高通量藥物篩選的全自動膜片鉗系統(tǒng)，應用面廣。
4. 客戶最多
無論是在國內還是在國外，超過80%的用戶使用AXON系列產品。Axon系列產品是被膜片鉗實驗室選用最多的產品。
5. 完善的售后服務體系
AXON在上海設有辦事處，提供強大的技術支持和售后服務。專業(yè)的代理公司為客戶提供專業(yè)的售前售后服務。
無論是在國內還是在國外，超過80%的用戶使用AXON系列產品。Axon系列產品是被膜片鉗實驗室選用最多的產品。
5. 完善的售后服務體系
AXON在上海設有辦事處，提供強大的技術支持和售后服務。專業(yè)的代理公司為客戶提供專業(yè)的售前售后服務。
標簽：
膜片鉗 原理 自動
