膜片鉗助力通過patch-seq技術記錄小鼠GABA神經元的轉錄和電生理特性

概述
本文通過多模態(tài)整合分析，對大腦皮層中的GABA能中間神經元進行了詳細的分類和描述。通過對517個GABA能神經元的形態(tài)重建，研究發(fā)現(xiàn)大部分轉錄組類型（t-types）在視覺皮層中占據特定的分層位置，且這些細胞在映射到特定t-type時表現(xiàn)出一致的電生理和形態(tài)特性。這些特性在不同t-types之間既有離散變化又有連續(xù)變化。最終定義了28種met-types，這些met-types具有一致的形態(tài)、電生理和轉錄組特性。

方法與結果
多模態(tài)數(shù)據收集與分析
本文通過Patch-seq技術收集了超過4,200個小鼠視覺皮層GABA能中間神經元的數(shù)據，包括超過500個神經元的形態(tài)重建。利用SMAR-Seq v4進行RNA測序，并通過Patch-seq記錄單個神經元的轉錄組和電生理特性。

形態(tài)與電生理特征
研究發(fā)現(xiàn)，不同t-types在視覺皮層中的位置各異。例如，Sst met-types中的Sst Calb2 Pdlim5型在L2/3層中有顯著的軸突投射，而Sst Tac1 Htr1d型則主要分布在L2/3層。此外，Pvalb met-types中的Pvalb Tpbg型和Pvalb Reln Itm2a型分別在L2/3層和L5層有廣泛的分布。這些發(fā)現(xiàn)揭示了不同met-types在皮層中的精細定位及其對應的電生理特性。

met-types的定義與分類
通過整合形態(tài)學、電生理學和轉錄組學數(shù)據，本文定義了28種met-types。這些met-types不僅在轉錄組上一致，而且在電生理和形態(tài)特征上也高度相似。例如，Sst met-types包括Sst Chodl t-type、Sst Mme Fam114a1 t-type等，這些類型的細胞在L2/3層或L5層中具有特定的軸突內分布模式和電生理特性。Pvalb met-types如Pvalb Tpbg型和Pvalb Reln Itm2a型也在相應的皮層區(qū)域中表現(xiàn)出獨特的特征。

以下為實驗研究內容圖表：

圖1：從Patch-seq記錄中獲得的scRNAseq數(shù)據的轉錄組學分析。

(A)  補丁序列數(shù)據收集和處理管道的摘要。

(B)   基于基因表達主成分的轉錄組UMAP圖（方法；左：n=6080個分離細胞，黑色，n=3855個來自Patch-seq記錄的細胞，灰色）。中間和右邊的圖中的顏色表示t型。

(C)   標記基因在每個t型內的表達分布由成對的小提琴圖表示，它們對應于Patch-seq記錄和分離的細胞（Tasic et al.，2018）（每種類型的每列分別為右和左）。行是基因，黑點是中位數(shù)。每一行中的值在0和檢測到的最大值之間標準化（y軸上顯示），在log10的比例上顯示。在兩個數(shù)據集中，每個t型細胞的(D)層分布。在每一列中，分離的細胞和Patch-seq記錄分別顯示在左邊和右邊。每種類型的Patch-seq記錄和分離細胞的細胞總數(shù)分別顯示在每一列的左右下方。對于(C)和(D)，只有來自轉基因株系的細胞這兩個數(shù)據集的共性，只使用了至少5個細胞的類型（n=4651個分離細胞和n=2260個Patch-seq記錄）。

(D)  只顯示了具有特定層分配的細胞（n=3767個分離細胞和n=2260個Patch-seq記錄）。

圖2：不同t型細胞在公共參考空間中的單元格的位置。

(A)  所記錄的細胞（n=2,930個細胞）位置的冠狀視圖，按轉錄組亞類組織，并按t型著色。視覺區(qū)域用一個較淺的背景來表示。為了清晰地顯示，每種t類型都在單個皮質半球上可視化。插圖顯示了虛擬冠狀面切片的自上而下的位置。插入的比例尺：2 mm。

(B)   與t型（n=2930個細胞）的距離，其位置與平均皮質層厚度對齊。

(A)和(B)中只顯示至少5個高度一致映射細胞的t類型。

圖3：轉錄組學類型的電生理學特征。

(A)  不同t型對1秒長電流步驟的反應實例，刺激振幅為−70pA和流變基（下痕跡）和流變基+80pA（上痕跡）。每個t型都有兩個隨機選擇的例子。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms.

(B)    UMAP圖，基于z評分的電生理稀疏主成分（sPCs）的投影。顯示了所有細胞的四個示例sPCs的值（n=4,270）。

(C)   電生理學UMAP圖顯示了2955個細胞。

(D)  電生理學UMAP圖，突出顯示個體t型。箭頭表示(A).中所示的示例的位置（填充：左，空心：右）。

圖4：轉錄組學類型的形態(tài)學特征。

(A)  t型的代表性形態(tài)重建（由NBLAST相似性評分選擇，方法選擇）。右側顯示了從所有t型重建中計算出的樹突和軸突深度直方圖，以及軀體深度位置（黑點）。樹突的顏色較深，軸突的顏色較淺。直方圖顯示為平均（線）±掃描EM（陰影區(qū)域）。

(B)  單個細胞軸突深度直方圖與其t型平均直方圖之間的相關性。在(B).中，只顯示了至少有5個高度一致的映射細胞的t型。

圖5：滿足類型的定義和類型預測精度。(A)t型與無監(jiān)督聯(lián)合電生理和形態(tài)學聚類結果的比較（(A)型）。同時顯示了高度一致和中等一致的細胞（n=503）。me型/t型組合之間的交叉映射的(B)圖可視化。節(jié)點表示在(A)中具有特定me型/t型組合的細胞，節(jié)點的大小表示細胞的數(shù)量。邊緣表示在一個給定的me型/t型組合中存在的細胞，它們有一定的概率映射到另一個t型（橙色線）或me型（藍色線）；較粗的線表示更高的概率。沒有顯示只有一個單元格和沒有連接的節(jié)點。概述的組表明連接良好的me型/t型組合，形成28個met類型（方法）。(C) River圖顯示了t型（底部）和相遇型（頂部）之間的關系。(D)隨機森林分類器的袋外混淆矩陣，訓練后從電生理特征預測t子類（左）和t類型（右）。只有t型與至少使用了10個高度一致的映射單元格。（E-F）與(D)相同，但僅從形態(tài)學特征(E)以及形態(tài)學和電生理特征來預測t類型(F)。只使用至少有5個高度一致的映射細胞的t型。(G)與(D)相同，但可從形態(tài)學和電生理特征來預測met類型。只使用至少有5個單元格的滿足類型。對于（D-G），這些值被歸一化為行和。
 

圖6：已鑒定的Sst和Pvalb抑制相遇類型的總結。(A)每個Sst相遇類型的形態(tài)和電生理反應的例子。在形態(tài)學圖中，體細胞分布在左側的條形圖表示（較厚： 25%至75%范圍，較�。� 5%至95%范圍）。平均軸突深度直方圖顯示在右邊（歸一化到其最大值）。比例尺： 200µm。電生理學的例子包括超極化電流步驟（−70或−90pA，下）誘發(fā)的反應，流變基的反應（下），以及流變基+ 40 pA刺激誘發(fā)的反應（上）。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms。流變基軌跡的平均第一個峰值的相位圖顯示在示例軌跡的下面；子類范圍的平均值是灰色虛線�；�于基因表達（上圖1B）和電生理特征（下圖3B-c）的(B)UMAPs，Sstmet類型以顏色顯示。在頂部，Patch-seq細胞顯示為淺灰色，分離的細胞顯示為深灰色。(C)在Sst相遇類型間差異表達的標記基因的點圖。

表達值（陰影）經過對數(shù)轉換并歸一化到最大值；點的大小表示在t型內表達該基因的細胞的比例。(D)通過Sst相遇型選擇形態(tài)學和電生理特征。平均值顯示為灰色菱形。測量了流變基+ 40 pA振幅響應的CVISI（峰間間隔的變化系數(shù)）。（E-H）與（A-D）相同，但對于Pvalbmet類型。在(D)中，在流變基處測量了第一個AP的潛伏期。另請參見圖S6和S7以及表S2和S3。

圖7：已鑒定出的Lamp5、Sncg和Vip抑制相遇類型的總結。(A)每個Lamp5相遇型的形態(tài)和電生理反應的例子。在形態(tài)學圖中，體細胞分布在左側的條形圖表示（較厚： 25%至75%范圍，較�。� 5%至95%范圍）。平均軸突深度直方圖顯示在右邊（歸一化到其最大值）。比例尺： 200µm。電生理學的例子包括超極化電流步驟（−70或−90pA，下）誘發(fā)的反應，流變基的反應（下），以及流變基+ 40 pA刺激誘發(fā)的反應（上）。比例尺：垂直50 mV，水平250 ms。流變基軌跡的平均第一個峰值的相位圖顯示在示例軌跡的下面；子類范圍的平均值是灰色虛線。(B) UMAPs基于基因表達（上圖1B）和電生理特征（下圖3B-C），Lamp5met類型以顏色顯示。在頂部，Patch-seq細胞顯示為淺灰色，分離的細胞顯示為深灰色。(C)在Lamp5集合中差異表達的標記基因的點圖類型表達值（陰影）經過對數(shù)轉換并歸一化到最大值；點的大小表示在t型內表達該基因的細胞的比例。(D)Lamp5-MET-1相遇型細胞流變基掃描中Npy表達、軸突寬度：高度比和首次AP的潛伏期。數(shù)值與第三個轉錄組主成分（PC-3）相對應，從4020個差異表達基因的第三個轉錄組主成分（PC-3）中計算出來�；疑�線為滾動平均值（10個單元格的窗口）。（E-G）與（A-C）相同，但對于Sncg滿足類型。(H)Sncg元型之間的電生理特征差異。平均值顯示為灰色菱形。測量了流變基+ 40 pA振幅響應的CVISI（峰間間隔的變化系數(shù)）。（I-K）與（A-C）相同，但對于Vipmet類型。(L)與(H)相同，但對于Vip滿足類型。測量了流變基+ 40 pA振幅響應的時間發(fā)射分數(shù)。

結論
本文的研究結果為理解大腦皮層GABA能中間神經元的類型提供了系統(tǒng)的框架。通過整合多種數(shù)據分析方法，本文不僅揭示了不同met-types的精細分類，還展示了這些類型在皮層中的精確定位及其電生理特性。這一研究為未來進一步探索神經元類型及其功能提供了重要的基礎。

文獻參考：Gouwens, Nathan W et al. “Integrated Morphoelectric and Transcriptomic Classification of Cortical GABAergic Cells.” Cell vol. 183,4 (2020): 935-953.e19. doi:10.1016/j.cell.2020.09.057

番外
這項研究中提出的新的分類方法對理解大腦功能和疾病的意義何在？
研究中的分類方法對理解大腦功能和疾病的意義，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
1. 提供更精確的神經元類型定義：通過整合形態(tài)、電生理和轉錄組數(shù)據，本文定義了28種met-types，這些met-types不僅在轉錄組上一致，而且在電生理和形態(tài)特征上也高度相似。這種綜合分類方法提供了一種更為精確和系統(tǒng)的方式來識別和定義不同的神經元類型。
2. 揭示不同神經元類型的精細定位和特性：研究發(fā)現(xiàn)，不同met-types在視覺皮層中的位置各異，且具有特定的軸突內分布模式和電生理特性。例如，Sst met-types中的Sst Calb2 Pdlim5型在L2/3層中有顯著的軸突投射，而Sst Tac1 Htr1d型則主要分布在L2/3層。這些發(fā)現(xiàn)揭示了不同met-types在皮層中的精細定位及其對應的電生理特性。
3. 為研究大腦功能和疾病提供新的視角：通過對GABA能中間神經元的詳細分類和描述，本文為進一步研究這些細胞的功能和相互作用提供了基礎。這有助于理解大腦在不同狀態(tài)下（如健康和疾病）的工作機制，并可能揭示與特定疾病相關的關鍵神經元類型。

綜上所述，這項研究中提出的新的分類方法不僅提高了我們對大腦神經元類型的認知精度，還為進一步研究大腦功能和疾病提供了重要的理論基礎和應用前景。