利用eXtended Performance（XP）色譜柱改進美國藥典（USP）噻康唑有機雜質分析方法

Kenneth D.Berthelette、Mia Summers和Kenneth J.Fountain

沃特世公司，美國馬薩諸塞州米爾福德

方案優(yōu)勢
■ 使用XP色譜柱改進耗時的USP美國藥典有機雜質分析方法，實現(xiàn)更快速的分析并減少溶劑的使用量，同時仍符合美國藥典<621>章指南的規(guī)定。
■ 將樣品運行時間縮短80%，從而提高了生產能力。
■ 將溶劑用量減少90%，降低了運行成本。

沃特世提供的解決方案
ACQUITY UPLC^® H-Class系統(tǒng)
Alliance^® HPLC系統(tǒng)
XSelect™ CSH™ C₁₈色譜柱
Empower^® 3軟件
eXtended Performance [XP] 2.5 μm色譜柱 TruView™ LCMS認證最大回收樣品瓶

關鍵詞
美國藥典方法、噻康唑、ACQUITY UPLC色譜柱計算器、沃特世反相色譜柱選擇表、仿制藥

引言
全世界的制藥企業(yè)在日常工作中都需要對仿制藥中的有機雜質進行分析。使用較為陳舊的儀器和色譜柱技術進行有機雜質分析，因為需要長時間使用大量的溶劑，所以既耗時又費錢。然而通過使用顯著改進的儀器和色譜柱技術有機雜質分析會變得更高效。2.5μm 粒徑的eXtended Performance（XP）色譜柱設計用于高效液相色譜和超高效液相色譜。該色譜柱是改進美國藥典方法的理想選擇，因為其能夠使色譜分析工作者實現(xiàn)更小粒徑和低擴散系統(tǒng)帶來的利益，同時能夠符合美國藥典<621>章色譜分析指南的規(guī)定。<621>章列出了允許的方法變化幅度。

噻康唑是一種用于治療酵母菌感染的咪唑類抗真菌化合物。被轉換的方法是噻康唑有機雜質的分析方法2。有機雜質分析方法用于測定樣品中是否存在雜質及其含量。該XP色譜柱方法是從最初在HPLC系統(tǒng)上的色譜柱規(guī)模的美國藥典方法縮放至HPLC和UPLC儀器上的。在HPLC儀器上使用XP色譜柱對現(xiàn)行美國藥典方法進行改進能夠縮短運行時間，從而提高了常規(guī)分析實驗室的樣品通量。而在UPLC系統(tǒng)上使用XP色譜柱則可以比HPLC進一步縮短運行時間并減少溶劑的使用，從而節(jié)約了總成本。

實驗條件
Alliance 2695 HPLC色譜條件
流動相： 44:40:28乙腈/甲醇/水加2 mL氫氧化銨
分離模式： 等度洗脫
檢測波長： 219 nm
色譜柱（L1）： XSelect CSH C₁₈，4.6 x 250 mm，5 μm，
部件號：186005291；XSelect CSH C₁₈ XP，4.6 x 150 mm，2.5 μm，
部件號：186006729；XSelect CSH C₁₈ XP，4.6 x 100 mm，2.5 μm，
部件號：186006111
柱溫： 25 ℃
洗針液： 95:5乙腈/水
樣品清洗液： 95:5水/乙腈
密封墊沖洗液： 50:50甲醇/水
流速： 根據(jù)方法調整
進樣量： 根據(jù)方法調整

ACQUITY UPLC H-Class色譜條件
流動相： 44:40:28 乙腈/甲醇/水加2 mL氫氧化銨
分離模式： 等度洗脫
檢測波長： 219 nm
色譜柱（L1）： XSelect CSH C₁₈ XP，4.6 x 150 mm，2.5 μm，
部件號：186006729；XSelect CSH C1₈ XP，4.6 x 100 mm，2.5 μm，
部件號：186006111；XSelect CSH C1₈ XP，2.1 x 150 mm，2.5 μm，
部件號：186006727
柱溫： 25℃
洗針液： 95:5乙腈/水
樣品清洗液： 95:5水/乙腈
密封墊沖洗液： 50:50甲醇/水
流速： 根據(jù)方法調整
進樣量： 根據(jù)方法調整
數(shù)據(jù)管理： Empower 3軟件

用100%的甲醇將噻康唑樣品制備成表1所述的濃度。將樣品轉移至一個進樣用的TruView最大回收樣品瓶中（部件號：186005662CV）。

結果與討論
全世界制藥企業(yè)都需要對常規(guī)方法制備的噻康唑進行日常分析。本應用紀要使用美國藥典專論中規(guī)定的有機雜質分析方法，在幾種不同規(guī)格的色譜柱上對噻康唑及其有關物質A、B、C的分離進行了比較。因為噻康唑許多雜質缺乏實際可用性，所以將噻康唑有關物質A、B、C用作低濃度雜質標準品。美國藥典所列的有機雜質分析方法用于分析復雜的樣品處方。樣品中多種成分的有效分離通常需要使用更長的色譜柱。使用較大填料粒徑（≥3.5 μm）的長色譜柱會使運行時間加長，溶劑使用量增大。例如，最初的美國藥典中的噻康唑有機雜質分析需要使用4.6 x 250 mm，5 μm的色譜柱，分離時間長達30分鐘，每分析一個樣品需要耗費30 mL溶劑。但是，使用2.5μm粒徑的eXtended Performance（XP）色譜柱，可以在縮短運行時間的同時仍然符合考核的要求。由于運行時間縮短，樣品通量得到了提高，每次分析所需溶劑減少，從而降低了總成本�，F(xiàn)行的美國藥典<621>章色譜分析指南規(guī)定了允許的方法變化幅度。這些允許的變化包括±70%的色譜柱長度變化，-50%的粒徑變化，±50%的流速變化。1美國藥典要求有關物質B和C之間的分離度要達到1.5，本應用紀要證明:在不同的色譜柱和不同的色譜系統(tǒng)之間進行的方法轉換完全滿足對這兩個難分離化合物的苛刻要求。

在HPLC儀器上使用XP色譜柱進行有機雜質分析
噻康唑的有機雜質分析方法需要使用L1專用色譜柱，為該分離而列出的色譜柱是LiChrosorb RP-182。參照沃特世反相液相色譜柱選擇表，本文選用更先進的XSelect CSH C18固定相色譜柱。之所以選擇XSelect CSH C₁₈色譜柱是由于其與所列出的色譜柱相類似，并且能提供適用于HPLC UPLC儀器的各種規(guī)格和粒徑。本文首先使用一根XSelect CSH C₁₈，4.6x250mm，5μm色譜柱在Alliance HPLC系統(tǒng)上運行美國藥典方法，流速1.0mL/min。如表2所示，本次分離符合考核標準。本次分離的總運行時間為30分鐘，在連續(xù)批量分析樣品時，將面臨著時間和成本管理的雙重挑戰(zhàn)。如果使用原始的美國藥典方法， 8小時的一個工作日僅能分析16個樣品，要消耗480mL溶劑。通過使用XP色譜柱，在同樣的8小時工作日內可分析80個樣品，且僅需使用240mL溶劑，顯著地提高了樣品通量并降低了運行成本。

在不同的系統(tǒng)上使用2.5μm XP色譜柱改進的標準方法具有通用性，同時仍符合美國藥典<621>章指南的要求，如圖1所示。XP色譜柱是一款2.5-μm顆粒的HPLC和UPLC色譜柱，經高效填裝并能夠承受UHPLC系統(tǒng)的高壓，使XP色譜柱在HPLC和UPLC儀器上均能使用。

 

本紀要的標準方法首先從最初的4.6 x 250 mm，5 μm色譜柱轉換至4.6 x 150 mm，2.5 μmXP色譜柱，用以說明使用更小粒徑的色譜柱可以縮短運行時間。使用更小的粒徑還可以提高分離能力，用色譜柱長度與粒徑的比值（L/dp）即可預測。在本例中，L/dp從50,000（初始條件）提高到60,000（4.6 x 150 mm XP色譜柱）。根據(jù)ACQUITY UPLC色譜柱計算器的計算，用于該XP色譜柱的最佳流速為2.0 mL/min3。但是，這個流速超出了美國藥典<621>章指南規(guī)定的變化范圍。故采用1.0 mL/min的流速以保證符合美國藥典指南的規(guī)定，同時也適應HPLC系統(tǒng)反壓的限制。噻康唑及其有關物質在原始色譜柱上與在4.6 x 150 mm XP色譜柱上的分離進行了對比，如圖2A-B所示。4.6 x 150 mm XP色譜柱將運行時間縮短43%，分離度提高5%，如圖2所示。

接著使用一根更短的4.6 x 100 mm，2.5 μm XP色譜柱進行分離，用以說明在實現(xiàn)更快速分離的同時，仍保持著合格的分離度。運行時間的縮短對于有機雜質分析尤其有用歸因于附加的分離復雜性，這些方法一般比其他方法具有較長的運行時間。需要注意的一個重要問題是，不一定任何時候都會選用具有較低分離能力（L/dp 40,000）的較短色譜柱。例如在輔料和雜質洗脫時間很接近的情況下可能需要保持原始的分離能力。圖2C顯示了使用4.6 x 100 mm，2.5μm XP色譜柱進行分離時，與初始條件相比，運行時間縮短57%，并且仍然符合所有的考核標準，如圖2所示。在這種情況下，L/dp從50,000（初始條件）降低至40,000導致有關物質B與C之間的分離度降低15%；但分離度仍然符合要求，這取決于原始分離的復雜程度。

在UPLC儀器上使用XP色譜柱進行有機雜質分析
如圖1所示，通過同時使用XP色譜柱和ACQUITY UPLC色譜柱計算器，該方法可以從Alliance HPLC系統(tǒng)轉換至ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)上。更新的儀器，例如ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)，可以實現(xiàn)更快速、更高效的分離，歸因于其高反壓耐受能力、進樣之間更快速的平衡以及顯著降低的系統(tǒng)體積和擴散。為了對比HPLC和UPLC系統(tǒng)之間的分離能力，將圖2B中所示的使用4.6 x 150 mm，2.5 μm顆粒的 XP色譜柱進行的有機雜質分析方法在ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)上重新運行，如圖3A所示。僅儀器本身的變化——從HPLC變到UPLC，會使B與C色譜峰之間的分離度增加5%，使運行時間縮短12%，如表2和表3所示。分離度的增大歸因于UPLC系統(tǒng)的低系統(tǒng)體積和低擴散，因為這兩個屬性都可以改善峰形。

 

為進一步說明UPLC儀器的優(yōu)點，如圖3B所示在UPLC系統(tǒng)上使用4.6 x 100 mm XP色譜柱進行分離。此分離操作使B與C色譜峰之間的分離度從使用HPLC系統(tǒng)時的1.6（參見表2）提高到使用UPLC系統(tǒng)時的1.8（參見表3）。在UPLC系統(tǒng)上使用4.6 x 100 mm XP色譜柱，得到與在HPLC系統(tǒng)上用原始方法分離相同的分離度，但是比原始方法快57%。

最后，將標準方法轉換至一根2.1 x 150 mm 2.5 μm XP色譜柱上。這根色譜柱的測試結果說明通過減小色譜柱的內徑，在保留相同分離度的同時，還能進一步縮短運行時間，并且大大減少溶劑用量。根據(jù)ACQUITY UPLC色譜柱計算器的計算，適合這根色譜柱的流速為0.42 mL/min。但這個流速超出了美國藥典<621>章指南的要求，因此實驗使用符合規(guī)定的0.5 mL/min流速。分析得到的色譜圖（如圖3C所示）顯示，如表3所示與原始條件相比運行時間縮短80%，而適用性要求仍很容易達到。此外，僅僅通過減小色譜柱的內徑分析就比使用4.6 x 150 mm XP色譜柱快63%，如圖3A所示。最后，通過使用2.1 x 150 mm XP色譜柱，與原始的標準方法相比，溶劑用量減少90%，顯著地節(jié)約了成本。當對流速進行調整，以保持在美國藥典<621>章指南規(guī)定的范圍內時，B和C色譜峰的分離度從1.9下降至1.8，但仍符合考核標準。

結論
在進行既耗時又費錢的有機雜質分析時，在現(xiàn)有HPLC系統(tǒng)上使用eXtended Performance [XP] 2.5 μm色譜柱，與原始的美國藥典方法相比，可以縮短運行時間和減少溶劑用量57%。通過將XP色譜柱與UPLC儀器相結合，運行時間可減少80%，溶劑用量可減少90%。既能在HPLC儀器上運行又能在UPLC儀器上運行的XP色譜柱的實用性可以用于在遵循現(xiàn)行美國藥典<621>章指南的同時，改進美國藥典方法。在常規(guī)分析實驗室中，使用經更小粒徑色譜柱改進的美國藥典方法，可以節(jié)約大量的時間和運行成本。

參考文獻
1. USP General Chapter <621>, USP35-NF30, 258. The United States Pharmacopeial Convention, official from August 1, 2012.
2. USP Monograph. Tioconazole, USP35-NF30, 4875. The United States Pharmacopeial Convention, official from August 1, 2012.
3. Jones MD, Alden P, Fountain KJ, Aubin A. Implementation of Methods Translation between Liquid Chromatography Instrumentation. Waters Application Note 720003721en. 2010 Sept.