基因芯片實(shí)驗(yàn)原理與方法

本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)會(huì)cDNA芯片的使用方法。了解各種基因芯片的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。

基因芯片這一技術(shù)方法在1991年的Science雜志上被首次提出，其高通量、并行檢測(cè)的特點(diǎn)適應(yīng)了分析人類基因組計(jì)劃所提供的海量的基因序列信息的需要，可以說，人類基因組計(jì)劃是基因芯片技術(shù)發(fā)展的原因，而對(duì)深人研究基因突變和基因表達(dá)的有效方法的需求又是促進(jìn)基因芯片技術(shù)發(fā)展的動(dòng)力。

由于基因芯片高速度、高通量、集約化和低成本的特點(diǎn)，基誕生以來就受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，正如晶體管電路向集成電路發(fā)展的經(jīng)歷一樣，分子生物學(xué)技術(shù)的集成化正在使生命科學(xué)的研究和應(yīng)用發(fā)生一場(chǎng)革命。

根據(jù)固定在芯片載體上的核酸分子的不同，基因芯片可以分為cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。寡核昔酸芯片主要基于光引導(dǎo)聚合技術(shù)，該技術(shù)是Affymetrix公司開發(fā)的專利技術(shù)，由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。

二、原理

基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又稱DNA微陣列(DNA Micorarray)，是指按照預(yù)定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個(gè)核酸分子所組成的微點(diǎn)陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補(bǔ)的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進(jìn)行標(biāo)記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測(cè)到雜交信號(hào)。

基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析。

1、芯片制備-目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機(jī)器人技術(shù)。以便能快速、準(zhǔn)確地將探針放置到芯片上的指定位置。

2、樣品制備-生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時(shí)樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴(kuò)增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測(cè)的靈敏度和使用者的安全性。
 
3、雜交反應(yīng)-雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯(cuò)配率。

4、信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果分析-雜交反應(yīng)后的芯片上各個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的熒光位置、熒光強(qiáng)弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。

目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩大類組成。以下分別介紹這兩類芯片的基本原理和特點(diǎn)：

寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip)

概念：是指做在固相載體上的寡核苷酸微陣列。其制備方法以直接在基片上進(jìn)行原位合成為主、有時(shí)也可以預(yù)先合成，再按照制備cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In situ synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法，有幾種不同的工藝，其中最著名的是美國Affymetrix公司(http://www.affymetrix.com)的專利技術(shù)——光引導(dǎo)化學(xué)合成法(Light-directed chemical synthesis process)。產(chǎn)品名為GeneChip。