蝦肝腸胞蟲（EHP）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）使用說明書

蝦肝腸胞蟲（EHP）核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明 

動物病害檢測系列可針對水樣、餌料、活禽、水生動物及相關(guān)加工品等樣品中病原生物體的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過實時擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本產(chǎn)品用于對蝦肝腸胞蟲（EHP）的檢測，檢出限為10³copies/μL基因組DNA。

• 產(chǎn)品組成（96測試）

• 適用儀器

ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。

• 自備耗材和儀器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬��；⑥均質(zhì)機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴(yán)格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當(dāng)體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

①樣品的采集和制備是蝦肝腸胞蟲檢測的重要步驟，為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性消耗品，研缽應(yīng)經(jīng)160℃干烤2 h，其他不宜干烤或高壓處理的器皿應(yīng)使用1%次氯酸鈉溶液浸泡。②取樣應(yīng)盡量采取肝胰腺組織，對于同一批樣品，應(yīng)多點采集合并后，作為一份樣品進(jìn)行均質(zhì)，提取DNA。③采樣過程應(yīng)快速完成，將采取的樣品放入無菌均質(zhì)袋中均質(zhì)成糜狀，充分混勻。

• 實驗操作

1.模板制備（樣本制備區(qū)）

請參照水生動物病害基因組DNA快速提取試劑盒說明書的提取步驟。

2.添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒上進(jìn)行）

剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-EHP-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

4. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團(tuán)選擇FAM，淬滅基團(tuán)選擇TAMRA。

按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

其他儀器請參照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置。

• 結(jié)果判定

檢測樣品無Ct值或≥40，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，可報告樣品陰性，不含有EHP或含量低于檢出限；

檢測樣品Ct≤36，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報告樣品陽性，含有EHP；

檢測樣品36<Ct≤40，需進(jìn)行一次重復(fù)實驗，若Ct值仍處于36和40之間且呈“S”型擴(kuò)增曲線，同時陰性對照無Ct值，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴(kuò)增曲線，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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