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LED光源在熒光顯微成像中的應用簡述

瀏覽次數(shù):6708 發(fā)布日期:2019-5-20  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負

熒光顯微鏡中的LED光源具有便利與綠色環(huán)保的優(yōu)點。這些LED能夠保持研究成分的有效性,特別是對成像和敏感樣品的保存。
LED技術在我們的生活中發(fā)揮越來越重要的作用。在過去的50年里,該技術的應用已從簡單的電子產(chǎn)品指示燈擴展到替代白熾燈以節(jié)約大量能源。LED具有高強度、使用壽命長、可控制性及光譜輸出穩(wěn)定的特點,因此發(fā)展出了一些不為大家所熟知的專業(yè)照明應用。

圖1. 熒光顯微鏡的基本構造
將熒光顯微鏡中的燈泡替換成LED已大大降低了其運行成本。這種技術在生命科學中廣泛用于單細胞或多細胞生物標本的研究。該研究涉及到使用光學顯微鏡(圖1)激發(fā)出特定波長的光。通過一種被稱作為斯托克斯(Stokes)位移的過程,例如熒光光譜和拉曼光譜,重新激發(fā)出更長波長的光。斯托克斯位移即相同電子躍遷吸收和發(fā)射光譜帶頂位置之間波長或頻率單元的差異。
使用不同的熒光團來標記樣品,即在不同的區(qū)域使用不用的熒光顏色,則可形成高對比度的多色照片(圖2)。

圖2. 使用CoolLED公司pE-300white拍攝的帶有熒光標記的皮膚圖像
滿足光譜需求
一些研究中需要使用活細胞成像,另一些需要使用被化學試劑固定于某一特定生命時期的細胞。不論何種情況,用于照明樣本的光源的類型和設計對顯微鏡所需的硬件以及所記錄圖像的質(zhì)量和有效性都有極大的影響。
早期使用LED系統(tǒng)的一個重要原因在于使用者及實驗室負責人的便利性。最常見的燈泡,例如100W高壓汞燈,其壽命很短,約為300小時。使用者通常會在記事本上記錄打開燈泡的時間,因為若使用燈泡的時間過長,則會增加爆炸的風險。然而,LED產(chǎn)品的使用壽命長達數(shù)萬小時。

燈泡的使用需要預熱與冷卻的時間,且在一整天內(nèi)都要打開。而LED光源可以在需要的時候以電子方式打開或關閉,即在觀察樣本或拍照期間打開光源,不使用期間可以關閉。盡管使用LED替代燈泡的優(yōu)點很多,但由于存在高強度及光譜范圍這兩個主要問題,LED的應用發(fā)展停滯不前。
由于LED光源的復雜性和成本,其發(fā)出的光不是寬光譜而是包含多達六個離散波長的高斯(Gaussian)光譜,并且具有約10nm至40nm的半峰寬(FWHM)。因此光源設計人員需要使用多個LED來滿足研究人員的光譜需求,這將產(chǎn)生新的光電和機械設計的復雜性,且這些問題對于傳統(tǒng)燈泡光源來說是不存在的。研究人員需要捕捉和校準LED芯片的朗伯發(fā)射,然后使用二色鏡組合出多種顏色。朗伯定律表明,從漫反射表面觀察到的發(fā)光強度與入射光方向和表面法線之間的角度θ的余弦成正比。
一種新穎且已獲得專利的方法采用了波長分組概念,即具有相近光譜的LED波長為一個用戶可選擇的通道。根據(jù)對高速應用的需求,合并具有相近光譜的四個LED。關鍵是要認識到,某些波長接近的分組,在相同的樣本中很少會用到。如今,研究人員可以使用包含高達16個波長的LED光源,使用這種方法能夠改善LED的強度、譜段范圍,也能夠降低成本。

目前可以使用的LED芯片的功率與100W汞燈泡中等離子弧產(chǎn)生的輻射相差甚遠。燈泡能夠發(fā)射極寬譜段范圍的能量,但在給定的約20nm的譜段范圍內(nèi),LED更有優(yōu)勢甚至超過了汞燈泡在360nm至800nm的大部分區(qū)域。
LED的過度使用在熒光應用領域非常常見,這使熱量管理變得極為重要。冷卻技術包括珀爾帖(Peltier)冷卻以及將未封裝的LED芯片放置在大型銅散熱片上。
長期以來,光譜的綠光區(qū)域與燈泡相比最弱,這部分區(qū)域在固態(tài)照明中被稱為“綠色空白”,也是LED光譜中極其微弱的區(qū)域。研究人員可以通過采用多種形式的熒光材料來解決這一問題。一種由飛利浦公司(Philips)取得專利權的方法使用由一系列明亮藍色LED組成的熒光棒。與單個LED相比,在常見的熒光顯微鏡上使用這種方法會增加成本且實用不方便。對藍色LED芯片功率的最新研究提出了更為簡單的解決方案,即在LED上直接放置熒光劑,且只選擇能夠提供最大綠色光譜區(qū)域的熒光劑。圖3中展現(xiàn)了由明亮綠色LED通過斯托克斯位移激發(fā)的紅色光。

圖3. 使用熒光標記的牛肺動脈內(nèi)皮細胞。藍色區(qū)域為細胞核,綠色區(qū)域為微管蛋白,紅色區(qū)域為肌動蛋白。圖片來源:Jordi Recasens/Izasa Scientific。
成像增強
顯微鏡的最終目標是獲取優(yōu)質(zhì)的圖像。然而,由于光毒性的影響,樣品觀測對實驗來說至關重要。通過提升LED的固有屬性可以同時改善圖像信噪比以及成像的反作用。
金屬鹵素燈引入后,充液燈開始廣泛使用,消除了為提高照明均勻度而校準燈泡的需要。這種均勻度的改善為制造性能良好的光擾頻器起到了指導性作用。LED由于其固態(tài)特性可以直接與顯微鏡連接,無需重新校準,并采用柯勒(Köhler)照明——一種現(xiàn)代科學光學顯微鏡樣品照明技術。利用這種方法,光源中的光學器件可將LED成像到顯微鏡物鏡的后孔徑上。這種反向工作的物鏡能夠在樣品的完整視野內(nèi)均勻地分散光線。然而一些LED仍與導光板一起使用,以減輕顯微鏡的重量和振動。
具有良好的阻擋和反射區(qū)域的濾光片能夠改善圖像的信噪比。在用于普通4',6-二脒基-2-苯基吲哚熒光(DAPI)成像(圖4)的激發(fā)和發(fā)射濾光片中,激發(fā)濾光片需要阻擋汞(Hg)光譜大部分藍色區(qū)域的能量。

圖4表示使用示例性的激發(fā)和發(fā)射濾光片覆蓋385nm LED的光譜以及DAPI吸收和發(fā)射的Hg光譜。
相比之下,用于激發(fā)DAPI的LED在相應的激發(fā)帶上產(chǎn)生了極低的能量,包括在相對較弱的樣品成像的藍色區(qū)域。對比結果為,使用LED作為光源能夠獲得更好的圖像信噪比,因為LED光源能夠減低樣品的背景水平。愛丁堡大學的Sandrine Prost及其同事們的研究表明采用波長可控制的獨立LED光源,其信噪比的提高超過了燈泡系統(tǒng),甚至超過了其他一些白色寬光源LED。
由于細胞不能暴露在高強度光下,因此觀測樣品也會影響到觀測結果。觀測樣品導致的反作用包括光漂白和光毒性,導致隨著時間推移信號減弱和活細胞的死亡或由照明引起的操作不當。減少樣品的照明時間對降低這些反作用的影響至關重要。傳統(tǒng)燈泡光源通過機械快門來控制曝光,這種方法有時會造成長時間的延遲,導致樣品在曝光時被不必要地照亮。
使用自動控制的LED光源則可以解決這個問題。LED的直接TTL控制通過提供以微秒計算時間的開/關來完善USB通信方式。許多高端攝像機在相機曝光時使用TTL輸出信號,該信號能夠與相機曝光精確配合,直接饋送至LED光源控制開關。由于兩至三個熒光標記的順序成像很常見,所以最新的LED將波長的階躍序列編程到光源中,隨著每個照相機的順序進行曝光。對于這種電路連接方式,不需要實時操控機械控制的快門以及電腦控制模塊,因而減少了不必要地樣品曝光。
最近,麥吉爾大學的Claire Brown及其同事們的研究表明,通過控制樣品曝光量,光漂白及光毒性的影響將大大降低。一個熒光原子吸收一個光子后將進入受激單能態(tài),理論上將釋放自身大部分的能量,激發(fā)出一個更長波長的新光子。然而,熒光原子也有可能進入有毒的三線態(tài)。如果處于三線態(tài)的熒光原子吸收了更多的光子,則額外的能量會使共價鍵的斷裂。這種方法同樣有助于降低光毒性和光漂白效果。

 
 
 
在使用快速線掃描法(可用于共焦系統(tǒng))的激光激發(fā)研究中,光漂白和光毒性的影響同樣被顯著降低。因為短時間內(nèi)受限的脈沖在曝光后進入間歇周期,使三線態(tài)的分子能夠返回到穩(wěn)定的基態(tài)。這方面的研究工作將繼續(xù)進行,由于LED的可控性以及快速開關切換能力,預期以LED作為光源也能得到相似的結果

340nm的大功率LED已經(jīng)在近期投入市場使用,其采用鈣熒光指示劑(Fura-2)進行鈣成像。該應用通過獲取神經(jīng)元網(wǎng)絡的活動信息進行阿爾茲海默病及其他相似病癥的研究。斯特拉思克萊德大學的Peter Tinning及其同事們的研究表示,使用340nm或380nm的強LED系統(tǒng)可以使細胞中鈣熒光指示劑濃度比標準細胞制備方案低25%。
該研究不僅為實驗研究節(jié)省了資金,更重要的是,能夠降低熒光標記可能導致的細胞毒性效應,以觀測到生物樣品更為典型的自然行為
來源:廣州科適特科學儀器有限公司
聯(lián)系電話:020-38102730
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