蛋白質和多肽反相HPLC分析和純化指南五

反相高效液相色譜和質譜（MS）的聯用為蛋白質/多肽分析提供了強大的工具。
20世紀80年代，約翰·貝內特·芬恩和他的同事們開發(fā)了電噴霧離子源，使質譜與反相高效液相色譜得以聯用。
采用液相色譜-質譜聯用的好處包括：

• 質譜是非常靈敏的檢測技術。

• 質譜可以提供所分離多肽/蛋白質的分子量。

• 質譜可利用分子量特異性檢測蛋白質。

• 片段信息有助于確認多肽。

• 質譜基于電荷和質量進行分離和測定，因此，與基于疏水性分離的反相色譜“正交”。

高效液相色譜-質譜聯用廣泛用于肽圖的分析，提供了一種正交檢測肽法（參考文獻15）。
如圖26所示，總離子質量色譜圖與紫外色譜圖相似，但由于正交檢測的使用，峰的大小不同。
事實上，采用紫外檢測出現的小峰在質譜圖中會更明顯（見圖26“^*”）。
 

圖26. 肽圖的分離可以通過紫外檢測和質譜檢測來監(jiān)測。
峰高是檢測法的一個函數，在紫外圖譜和質譜圖譜間有明顯不同。
特別是用“*”標示的肽對。它們在UV檢測圖譜中顯示的峰值較小，但在質譜圖中峰值較大。

 

通過測定每個峰中肽的分子量，質譜分析法為識別RP-HPLC法分離的峰提供了有用的信息。
由于質譜與反相高效液相色譜正交，因此質譜還能確定峰純度或顯示兩種或兩種以上肽的共洗脫，并能提供肽的分子量。
圖27以肽圖中的三個峰值展示了這一點。A峰較早洗脫出來，是分子量為439道爾頓的四肽。B峰是一種糖肽，有寡糖或多聚糖吸附。
通過質譜圖中B峰存在質荷比為204和366兩種離子確定，這表明存在糖基化反應。
C峰是一種二硫化物連接的二肽——由二硫鍵連接的兩個多肽。
顯示該肽有四種離子形式：+1、+2、+3和+4。只有含兩個氨基末端和兩個堿性氨基酸的二肽才會出現+4離子。

圖27. 反相色譜強大的分離能力與第二個維度的質譜的結合為肽圖提供了大量的信息。

A. MS確認A峰代表小分子肽。

B. 檢測到的B峰代表含多聚糖（糖）的肽。

C. C峰代表一種二肽——由二硫鍵連接的兩個肽。

 

HPLC-MS

 

聯用的兩個重要因素是電噴射接口的最佳流速及三氟乙酸對肽電離的影響

 

基本電噴霧接口的信號在5~10μL/min的流速區(qū)間上迅速下降（圖28）。
這與采用標準分析型HPLC柱的流速不相容。
目前，商用電噴霧提供一種高剪切流氮氣輔助的電噴霧（氣流輔助電噴霧），它將電噴霧的最佳流速區(qū)間提升到了200~500μL/min。
這仍然低于標準分析柱通常所用的最佳流速，因此，目前科學家在使用HPLC-MS時，普遍采用流速為200~300μL/min的細孔柱（內徑~2 mm）

 

圖28. 紅線表示基本電噴霧接口流速與信號響應的關系。藍線同樣表示氣流輔助電噴霧的信號響應。

 

 

 

如圖29所示，流動相中的TFA流入電噴霧接口導致蛋白質和多肽的信號減弱。
這是由于TFA和多肽間強烈的相互作用將多肽中和。

圖29. 使用電噴霧接口時，TFA的流入會大幅減弱多肽的信號。

 

 

有兩種方法可糾正由TFA引起的信號減弱：

• 忽略信號損失。通常，當信號足夠強大時，即使信號減弱也仍能獲得有用的數據。在這種情況下可以忽略信號損失。

• 當信號損失過多時，最佳的解決方案是將高純度硅膠柱與低濃度TFA結合使用。
  高純度硅膠柱與低濃度TFA一同使用仍能維持較好的峰形（圖30）。
  采用高純度硅膠柱能得到良好的信號響應和峰形。

其它方案包括用甲酸代替TFA或柱后采用乙酸或丙酸代替TFA。
但采用甲酸得到的峰形不如TFA，分離度也不如TFA，因此會影響性能。
這在蛋白質組學應用中可以接受，但在蛋白質治療藥物中不可行。
柱后替換TFA較為棘手，且會導致分辨率下降。

圖30. 高純度硅膠與低濃度TFA一同使用，保持肽的峰形。

 

 

色譜柱：ACE 5 C18, 4.6 x 250 mm（高純度硅膠）

洗脫液：加入如圖所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為37.5分鐘。