第三代水凝膠培養(yǎng)3D細胞類組織的應(yīng)用
越來越多的研究人員意識到，3D細胞培養(yǎng)模型比2D更接近體內(nèi)微環(huán)境，能提供更真實可靠的信息，是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域細胞功能研究的理想選擇。
伴隨著研究的普及和深入，用于3D培養(yǎng)的基質(zhì)水凝膠技術(shù)與時俱進地演變和更迭著，將基礎(chǔ)研究推向更有實用價值的臨床應(yīng)用和藥物研發(fā)的轉(zhuǎn)化。
第一代3D細胞培養(yǎng)基質(zhì)水凝膠主要有鼠尾膠或從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM，主要成分是膠原、層粘連蛋白以及生長因子，能很好的固定細胞，模擬體內(nèi)生長環(huán)境。動物來源的基質(zhì)膠取得了廣泛的成功應(yīng)用，是目前基礎(chǔ)研究中普遍使用的技術(shù)方法。但也存在諸多問題，如含有動物來源的成分、原料供應(yīng)不穩(wěn)定、批次間差異較大，特別是蛋白和生長因子的種類和數(shù)量變化無法控制，對細胞或類組織生長有很大的影響，在此基礎(chǔ)上建立的3D細胞模型也有可能不穩(wěn)定。膠原形成凝膠后不可逆，細胞無法從凝膠中分離出來。除此之外，實驗過程中，需要保持基質(zhì)膠及操作耗材的低溫，使用并非友好，難以高通量操作。
第二代水凝膠主要是人工合成多肽支架，在溫度或pH/離子強度變化下高度交聯(lián)，形成三維結(jié)構(gòu)，支持細胞和類組織生長。這類基質(zhì)膠已解決了成分可控和無異源物質(zhì)污染問題，批次穩(wěn)定，取得了進步。然而，多肽運輸保存必須維持在-20度以下，避免反復(fù)凍融。需要操作者嚴(yán)格遵守操作步驟，注意環(huán)境條件。
近年來，水凝膠在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面的研究，很好地將基礎(chǔ)科研推向臨床應(yīng)用。近期不僅有國外科學(xué)家在《Sicence》上發(fā)表的利用水凝膠作為生物墨水克服3D打印器官的一大障礙，打印出模擬肺功能的氣囊，體外實現(xiàn)向周圍血管輸送氧氣的功能。且有國內(nèi)科學(xué)家研發(fā)快速止血生物水凝膠，用于數(shù)秒內(nèi)止住大動脈損傷和心臟穿透傷大出血的仿生材料。
那么我們看看，是Hydrogel的哪些特質(zhì)使得這么多科學(xué)家越來越青睞于開發(fā)水凝膠的應(yīng)用呢？
以芬蘭UPM BioMedicals的科學(xué)家研發(fā)出3D細胞培養(yǎng)水凝膠GrowDex為例，其所具備的特性，代表了這一類水凝膠的優(yōu)勢。
1. 無動物源，批間穩(wěn)定
GrowDex是從純植物樺樹中提純的一種纖維素水凝膠，成分單一明確，不包含異源物質(zhì)，無人源或動物源成份，不含內(nèi)毒素，pH值中性。因此，建立的3D培養(yǎng)模型可重復(fù)性高，培養(yǎng)條件高度可控，科學(xué)家可自行組合優(yōu)化所需生長因子和輔助試劑。組間一致性好，可用于高通量藥物篩選和藥效評估。生產(chǎn)工藝明確，采用GMP標(biāo)準(zhǔn)，可提供溯源文件，支持未來臨床申報。
2. 生物兼容，孔徑可調(diào)
GrowDex的納米纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)不僅允許營養(yǎng)素和氧氣等小分子物質(zhì)輕松擴散，且韌度（孔徑）可調(diào)，便于優(yōu)化支持各種類型細胞培養(yǎng)的3D微環(huán)境。200nm細小纖維素的交聯(lián)既為每種細胞的培養(yǎng)提供了個性化的培養(yǎng)空間，又處于動態(tài)平衡狀態(tài)，實時適應(yīng)細胞的運動和細胞之間的相互交流。目前已成功用于上百種細胞系、原代細胞、共培養(yǎng)體系、活檢組織、干細胞的培養(yǎng)和后續(xù)研究。
3. 無需交聯(lián)、使用簡單
GrowDex水凝膠的穩(wěn)定性強，可在室溫保存、運輸和使用，免去了嚴(yán)格的溫度控制要求和昂貴的冷鏈運輸。預(yù)置在注射器中，設(shè)計友好，是一種可直接使用的水凝膠。使用前無需交聯(lián)(cross- linking)、無需凝膠化(gelation)、無需超聲(sonication)或任何其他步驟。只需要推出水凝膠，混合培養(yǎng)基和細胞，鋪板和培養(yǎng)即可。
4. 一步回收、維持功能
當(dāng)細胞或類組織培養(yǎng)一段時間后，如需回收細胞，只需要在樣品中加入GrowDase纖維素酶，GrowDex即可降解成溶液，細胞或組織又重懸于培養(yǎng)基中�；厥斋@得的3D微球和組織，既維持了特定的形態(tài)和功能（App note 002），還可用于下游的分析和檢測，如測序和切片染色（App note 018）。
5.高通量操作、實現(xiàn)3D篩選
3D細胞模型逐漸被建立起來作為動物實驗的替代，特別是用于藥效研究、毒理評價，往往一次實驗的通量比較高，而以往的基質(zhì)膠系統(tǒng)在使用自動化工作站換液時，對液流速度和沖擊力非常敏感，膠體或交聯(lián)結(jié)構(gòu)溶液崩裂，或因?qū)囟让舾�，常常在高通量操作中粘附或堵住槍頭。GrowDex是一種浸沒在網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，用戶合理設(shè)置操作條件，已經(jīng)驗證GrowDex可在多種自動化系統(tǒng)上實現(xiàn)高通量接種、換液。（視頻）
6. 推動基礎(chǔ)向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化
除了上述所提到的無動物源成分以及采用GMP標(biāo)準(zhǔn)進行生產(chǎn)這兩大特點使得Growdex水凝膠可在基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過程中大放異彩外，更讓人驚喜的是，采用此水凝膠作為原料的一款用于促進皮膚移植后傷口愈合的產(chǎn)品已經(jīng)成功獲得歐洲CE認證（相當(dāng)于美國的FDA認證），被批準(zhǔn)用于臨床治療。（文獻Hakkarainen T. et al. Nanofibrillar cellulose wound dressing in skin graft donor site treatment. Journal of Controlled Release 2016; 16, 292-301.
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第一代3D細胞培養(yǎng)基質(zhì)水凝膠主要有鼠尾膠或從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM，主要成分是膠原、層粘連蛋白以及生長因子，能很好的固定細胞，模擬體內(nèi)生長環(huán)境。動物來源的基質(zhì)膠取得了廣泛的成功應(yīng)用，是目前基礎(chǔ)研究中普遍使用的技術(shù)方法。但也存在諸多問題，如含有動物來源的成分、原料供應(yīng)不穩(wěn)定、批次間差異較大，特別是蛋白和生長因子的種類和數(shù)量變化無法控制，對細胞或類組織生長有很大的影響，在此基礎(chǔ)上建立的3D細胞模型也有可能不穩(wěn)定。膠原形成凝膠后不可逆，細胞無法從凝膠中分離出來。除此之外，實驗過程中，需要保持基質(zhì)膠及操作耗材的低溫，使用并非友好，難以高通量操作。
第二代水凝膠主要是人工合成多肽支架，在溫度或pH/離子強度變化下高度交聯(lián)，形成三維結(jié)構(gòu)，支持細胞和類組織生長。這類基質(zhì)膠已解決了成分可控和無異源物質(zhì)污染問題，批次穩(wěn)定，取得了進步。然而，多肽運輸保存必須維持在-20度以下，避免反復(fù)凍融。需要操作者嚴(yán)格遵守操作步驟，注意環(huán)境條件。
近年來，水凝膠在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面的研究，很好地將基礎(chǔ)科研推向臨床應(yīng)用。近期不僅有國外科學(xué)家在《Sicence》上發(fā)表的利用水凝膠作為生物墨水克服3D打印器官的一大障礙，打印出模擬肺功能的氣囊，體外實現(xiàn)向周圍血管輸送氧氣的功能。且有國內(nèi)科學(xué)家研發(fā)快速止血生物水凝膠，用于數(shù)秒內(nèi)止住大動脈損傷和心臟穿透傷大出血的仿生材料。
那么我們看看，是Hydrogel的哪些特質(zhì)使得這么多科學(xué)家越來越青睞于開發(fā)水凝膠的應(yīng)用呢？
以芬蘭UPM BioMedicals的科學(xué)家研發(fā)出3D細胞培養(yǎng)水凝膠GrowDex為例，其所具備的特性，代表了這一類水凝膠的優(yōu)勢。
1. 無動物源，批間穩(wěn)定
GrowDex是從純植物樺樹中提純的一種纖維素水凝膠，成分單一明確，不包含異源物質(zhì)，無人源或動物源成份，不含內(nèi)毒素，pH值中性。因此，建立的3D培養(yǎng)模型可重復(fù)性高，培養(yǎng)條件高度可控，科學(xué)家可自行組合優(yōu)化所需生長因子和輔助試劑。組間一致性好，可用于高通量藥物篩選和藥效評估。生產(chǎn)工藝明確，采用GMP標(biāo)準(zhǔn)，可提供溯源文件，支持未來臨床申報。
2. 生物兼容，孔徑可調(diào)
GrowDex的納米纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)不僅允許營養(yǎng)素和氧氣等小分子物質(zhì)輕松擴散，且韌度（孔徑）可調(diào)，便于優(yōu)化支持各種類型細胞培養(yǎng)的3D微環(huán)境。200nm細小纖維素的交聯(lián)既為每種細胞的培養(yǎng)提供了個性化的培養(yǎng)空間，又處于動態(tài)平衡狀態(tài)，實時適應(yīng)細胞的運動和細胞之間的相互交流。目前已成功用于上百種細胞系、原代細胞、共培養(yǎng)體系、活檢組織、干細胞的培養(yǎng)和后續(xù)研究。
3. 無需交聯(lián)、使用簡單
GrowDex水凝膠的穩(wěn)定性強，可在室溫保存、運輸和使用，免去了嚴(yán)格的溫度控制要求和昂貴的冷鏈運輸。預(yù)置在注射器中，設(shè)計友好，是一種可直接使用的水凝膠。使用前無需交聯(lián)(cross- linking)、無需凝膠化(gelation)、無需超聲(sonication)或任何其他步驟。只需要推出水凝膠，混合培養(yǎng)基和細胞，鋪板和培養(yǎng)即可。
4. 一步回收、維持功能
當(dāng)細胞或類組織培養(yǎng)一段時間后，如需回收細胞，只需要在樣品中加入GrowDase纖維素酶，GrowDex即可降解成溶液，細胞或組織又重懸于培養(yǎng)基中�；厥斋@得的3D微球和組織，既維持了特定的形態(tài)和功能（App note 002），還可用于下游的分析和檢測，如測序和切片染色（App note 018）。
5.高通量操作、實現(xiàn)3D篩選
3D細胞模型逐漸被建立起來作為動物實驗的替代，特別是用于藥效研究、毒理評價，往往一次實驗的通量比較高，而以往的基質(zhì)膠系統(tǒng)在使用自動化工作站換液時，對液流速度和沖擊力非常敏感，膠體或交聯(lián)結(jié)構(gòu)溶液崩裂，或因?qū)囟让舾�，常常在高通量操作中粘附或堵住槍頭。GrowDex是一種浸沒在網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，用戶合理設(shè)置操作條件，已經(jīng)驗證GrowDex可在多種自動化系統(tǒng)上實現(xiàn)高通量接種、換液。（視頻）
6. 推動基礎(chǔ)向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化
除了上述所提到的無動物源成分以及采用GMP標(biāo)準(zhǔn)進行生產(chǎn)這兩大特點使得Growdex水凝膠可在基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化過程中大放異彩外，更讓人驚喜的是，采用此水凝膠作為原料的一款用于促進皮膚移植后傷口愈合的產(chǎn)品已經(jīng)成功獲得歐洲CE認證（相當(dāng)于美國的FDA認證），被批準(zhǔn)用于臨床治療。（文獻Hakkarainen T. et al. Nanofibrillar cellulose wound dressing in skin graft donor site treatment. Journal of Controlled Release 2016; 16, 292-301.
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