multiplex PCR預混液與六通道微滴數(shù)字PCR組合在同步準確定量的應用

法國Stilla Technologies公司開發(fā)的—款多重PCR專用預混液：naica^®multiplex PCR MIX（見表1），專用于naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的多重檢測。并對naica^®multiplex PCR MIX的多重檢測性能進行了詳細評估。當面對有限的樣本量時，可保證多重數(shù)字PCR檢測的靈敏度和準確性；在復雜背景基因存在的情況下，依然能精確檢出低豐度的目的基因。
 

★ naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進行6個靶標的同步準確定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA樣品，使用10X naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上進行6個靶標的線性范圍分析，結果顯示6個靶標的R²均＞0.99，說明在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)上，能夠可靠地實現(xiàn)6靶標同步準確定量（圖1)。與2X和5X濃度的數(shù)字PCR預混液(dPCR Mixes)相比，10X濃度的數(shù)字PCR預混液體積加入量降低了50％至80％，最大限度地提高樣品加入量。尤其是在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣品加入量的增加可提高檢測靈敏度。
 

▲ 圖1：使用naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR上進行6個靶標的線性分析，分別在藍色、青色、綠色、黃色、紅色和紅外線6個通道進行檢測。每個稀釋點的DNA濃度分別為：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每個稀釋度進行3次重復。結果顯示6個靶標的R²均大于0.99，說明所有靶標的結果都高度真實可靠。
 

★ 在復雜的背景基因下，對低豐度目的基因進行精確定量

數(shù)字PCR的—個重要技術優(yōu)勢是能夠在存在多個靶標擴增的情況下檢測到低濃度靶標。為了評估naica^®multiplex PCR MIX的穩(wěn)定性。使用同一個目標DNA模板的不同濃度系列稀釋液（0.2~ 13000 cp/uL)進行檢測，同時其中摻入5種外部靶標模板（每個靶標的濃度為3000 cp/ul)。在不同測試條件下，結果均呈現(xiàn)良好的線性關系（圖2A和2C)。這些結果與同一DNA 靶點在不同濃度下單獨檢測以及在不添加外部靶標的情況下獲得的結果具有可比性（圖2B和2D）。

▲ 圖2：使用naica^®multiplex PCR MIX的擴增結果真實可靠。將pUC18質粒（圖A和B)和pUC57質粒（圖C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀釋液在5個外部擴增靶標背景下（每個靶標為3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶標(B,D)的情況下進行定量檢測，3次重復。線性擬合系數(shù) R²>0.99，表明在不考慮多重背景的情況下，對所有靶標的測定結果都是真實可靠的。5個外部靶標的相對標準偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，顯示出極好的重復性。
 

★ naica^®multiplex PCR MIX應用亮點

☑  實現(xiàn)數(shù)字PCR方法多重檢測的高度穩(wěn)定性和高檢測靈敏度；

☑  可在naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的動態(tài)范圍內同時定量檢測6個獨立的DNA靶標，均具有良好線性關系；

☑  5X和10X的數(shù)字PCR預混液，提高了naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)高階多重檢測能力；

☑  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的體積用量，從而增加DNA的加入量。在檢測低濃度樣品或稀有靶標時，樣本加入量的增加可提高檢測靈敏度。
 

表1 naica^®multiplex PCR MIX貨號及規(guī)格

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質控，3小時內即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。