六重數字PCR檢測方法助力轉基因快速、準確、精準定量檢測

在當前全球化市場下，轉基因生物（GMO）的多樣性和復雜性不斷增加，對GMO檢測實驗室和政策制定者提出了許多新的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的qPCR技術在單次檢測中對GMO數量的限制使其在成本和效率存在局限性。為了解決這些問題，斯洛文尼亞國家生物研究所在foods發(fā)表了題為“ Fast and Accurate Multiplex Identification and Quantification of Seven Genetically Modified Soybean Lines Using SixColor Digital PCR ”的文章。本研究開發(fā)了一種創(chuàng)新的六色數字PCR技術，通過單一檢測實現對多個轉基因靶標的同時定量。

 文獻解讀：

本研究探索了六重檢測中量化五種轉基因大豆轉化體的能力，也探索了兩個四重檢測量化七種轉基因大豆轉化體的靈活性，實驗結果展示了該方法具備高度特異性、靈敏度和精確度。

本文遵循dMIQE2020的要求進行實驗，確保實驗的質量和結果的可靠性。

 應用亮點：

▶ 開發(fā)了六重數字PCR檢測方法，對五種轉基因大豆轉化體及大豆參考基因lectin(Le1)同時量化。

▶ 使用真實樣本驗證了該方法在復雜樣品中量化轉基因大豆轉化體的適用性。

▶ 與傳統(tǒng)的qPCR相比，該多重dPCR方法顯著節(jié)約時間和成本，提高檢測的效率。

該研究從轉基因大豆CRM中提取DNA。非盲樣本包括兩種DNA混合物，分別對應六重檢測的五種轉基因大豆轉化體和四重檢測的七種轉化體，用于檢測方法的特異性研究。盲樣樣本選擇了四個來自常規(guī)研究的樣本，用于檢測方法適用性研究。

 實驗結果：

1、特異性：

在非目標材料中沒有觀察到交叉反應，表明檢測方法能夠有效區(qū)分目標轉基因轉化體。

2、檢測限（LOD）和定量限（LOQ）：

LOD≤25拷貝/反應，LOQ≤50拷貝/反應或以下，部分靶標低至12拷貝/反應。

3、線性：

即使是在極低濃度下，所有靶標檢測均顯示出極佳的線性擬合度。

圖1. 6-plex檢測每個目的基因的線性。右下角顯示了R2值。X軸為每個反應的估計拷貝數，Y軸為每個反應的檢測的拷貝數。

圖4. 4-plex檢測每個目的基因的線性。右下角顯示了R2值。X軸為每個反應的估計拷貝數，Y軸為每個反應的檢測的拷貝數。

4、數據分析優(yōu)化：

研究采用了兩種數據分析優(yōu)化方法。

①. 通過空白限（LOB）校正，可以提高LOQ和LOD精確度。

②. 反應的合并孔分析，進一步降低了LOD，提高了檢測靈敏度。

5、方法適用性：

使用真實樣本進行測試，多重數字PCR檢測方法適用于量化復雜樣本中的低濃度轉基因成分。證明了dPCR方法在量化復雜樣品中低GMO含量方面的適用性。

結論：

本研究展示了GMO多重數字PCR檢測方法中極具應用潛力和適用性，特別是在復雜樣品和低靶標濃度檢測時，該方法依舊展示出極高的特異性、靈敏度和精確度，為在復雜樣品中全面分析GMO成分，提供了新思路和新方法。文中同時強調，在當下轉基因產品日益多樣化的趨勢下，采用創(chuàng)新技術進行有效地和高通量GMO檢測方法非常重要。

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