細(xì)胞色素b5（Cytochrome b5）含量測定試劑盒使用說明書

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。細(xì)胞色素P450和細(xì)胞色素b5是P450酶系的兩個血紅素蛋白，其比值的變化與P450代謝活性密切相關(guān)。

測定原理：
氧化型細(xì)胞色素b5經(jīng)連二亞硫酸鈉還原后，在424nm處有最大吸收峰，通過測定424nm和490nm處吸光值的差異，即可計算出細(xì)胞色素b5的含量。
 
自備儀器和用品：
可見分光光度計、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
 
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水，充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；
 
工作液配制：臨用前配制，戴一次性手套，小心打開試劑三瓶蓋，加試劑二50 mL充分溶解，4℃避光可保存1周。

樣品中細(xì)胞色素b5提取：
1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。
2、粗制微粒體：100 000g，4℃離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、待測液：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即待測液，該待測液需當(dāng)天測定。
 
細(xì)胞色素b5含量測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min。
2. 工作液置于25℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μ L蒸餾水，1000μ L工作液，室溫靜置2 min，424nm和490nm處吸光值，424nm處吸光值記為A空白管1，490nm處吸光值記為A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2
4. 測定管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μ L待測液，1000μ L工作液，室溫靜置2 min，424nm和490nm處吸光值，424nm處吸光值記為A測定管1，490nm處吸光值記為A測定管2�！鰽測定管= A測定管1- A測定管2。
注意：只需要做一個空白管。
 
樣品細(xì)胞色素b5含量計算公式：
(1).按照蛋白濃度計算:
細(xì)胞色素b5含量(nmol/mg prot)= (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）
                           = 123×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
(2).按照樣本質(zhì)量計算:
細(xì)胞色素b5含量（nmol/g 鮮重）= (△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總×（V樣總÷V樣）÷W
= 61.4×(△A測定管-△A空白管)÷W
ε：還原型細(xì)胞色素b5納摩爾消光系數(shù)，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm； V反總：反應(yīng)體系總體積，1.05 m L=0.00105 L；Cpr：待測液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應(yīng)體系中待測液體積，50 μ L=0.05 mL；V樣總：待測液總體積，0.5 mL；W：樣品質(zhì)量，g。