血管形成實驗步驟及常見問題解答

 
HUVEC細胞的背景：
 
     人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (HUVEC) 是從臍帶靜脈內(nèi)壁分離出來的原代細胞。內(nèi)皮細胞常用于研究低氧、炎癥、氧化應激、感染反應及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應用。
 
 
   血管形成實驗:
 
       體外血管形成實驗能夠很好的模擬腫瘤血管發(fā)生過程，并且適合研究某些基因或藥物對這一過程的影響。血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）在基質(zhì)膠（Matrigel）上保留了內(nèi)皮細胞增殖分裂快、遷移速度快的特點，用成管的方法可以快速參與血管的基因和信號通路等。
 
   HUVEC細胞形態(tài)：
 
 

問題1
 成功的血管形成需要具備的條件有哪些？
                                                                                      中喬科研小助手解答
 
 
1.huvec細胞：原代的huvec傳代次數(shù)有限，建議在2-8代內(nèi)進行實驗。
 
2.試劑的選擇：內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基、DMEM、FBS、基質(zhì)膠、96孔板或24孔板。

3.基質(zhì)膠的準備：

 A.提前24h將基質(zhì)膠放入4度冰箱過夜、進行解凍備用。

 B.第二天將24孔板放在冰盒上，將基質(zhì)膠用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基1:1進行稀釋一倍后離心，使基質(zhì)膠跟培養(yǎng)基混勻，24孔板里加入基質(zhì)膠100ul每孔，建議做重復孔；加基質(zhì)膠一定垂直滴入孔底部，減少氣泡產(chǎn)生，使用震蕩的方法讓膠均勻分布。
 
C.放入孵箱30-60分鐘讓其形成凝膠，凝膠是半固體，在加入細胞前是否凝固直接關(guān)系到實驗的成敗。
 
4.實驗步驟：
 
A.huvec細胞細達到80%匯合度后準備消化，一般過夜培養(yǎng)后的細胞狀態(tài)更佳，收集細胞進行計數(shù)，并按照需求梯度稀釋調(diào)整細胞的濃度，請一定保證細胞狀態(tài)完好。
 
B.24孔板加入200ul的huvec細胞懸液，濃度約為12-20萬個細胞,建議做復孔；
細胞加入后不應該移動培養(yǎng)板，放入37度孵箱約4小時左右即可進行觀察血管是否形成。
 
C.一般在15小時后成管會開始緩慢皺縮凋亡。
 
D.結(jié)果分析、圖片采集。根據(jù)需求可用固定后進行熒光染色。
 
 
 
成功的血管形成圖：
 
                             
 
Huvec成管后分析
imagej軟件分析步驟
 
FIle-open-打開圖片-找到angiogenesis analyze插件即可。軟件會自動變成如下的圖形。請點擊箭頭所指的網(wǎng)格狀圖標;
 
點擊網(wǎng)狀圖標后點擊analyze HUVEC phase contrast選項后經(jīng)過約幾分鐘時間即可生產(chǎn)如下圖一樣的圖片；
 
File-Save as 即可將圖片進行保存；
 
結(jié)果包括nodes節(jié)點。junctions交叉點。meshes網(wǎng)眼數(shù)還有網(wǎng)眼的面積。branches血管分支數(shù); length總長度、 branching length分支長度、segments length主干的長度。
     
                                                         

 
 
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                                                               中喬新舟原代huvec簡介     
 
1.我司提供HUVEC于P1代凍存，每管含有細胞數(shù)量>5X105cells/ml；
2.經(jīng)測試HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母菌、真菌，檢測均為陰性；
3.細胞來源正規(guī)，可溯源，可提供細胞流式及免疫熒光鑒定,可提供倫理報告；
                
                                                           熒光抗體vWF和CD31標記
 
4.HUVEC細胞專用培養(yǎng)基: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%胎牛血清+1%內(nèi)皮細胞生長因子+1%青鏈霉素。
 
                                                               內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基
                                                                   貨號：ZQ-1304
                               
 
5.HUVEC細胞包被液： HUVEC復蘇前建議使用重組人纖連蛋白進行包被，輔助HUVEC的粘附和細胞質(zhì)擴散。同時纖維粘連蛋白也適用于不能自身合成生物基質(zhì)的細胞培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。重組人纖連蛋白含有緩沖鹽。
 
                                                                重組人纖連蛋白
                                                                 貨號：CSP044
                                                      
6.HUVEC細胞的凍存：我司HUVEC細胞至少保證15次倍增，實驗過程中可進行凍存保種方便下次實驗使用。我司使用無血清凍存液，該凍存液含 DMSO、 葡萄糖等各種細胞營養(yǎng)成分，提高細胞存活率和活力，亦適合于無血清培養(yǎng)細胞和蛋白表達細胞。不含動物來源性蛋白， 不含血清，可減少各類細菌、病毒和支原體等污染，保證凍存細胞的安全。 通用于各種動物細胞株（腫瘤細胞和常規(guī)細胞）， 凍存細胞可在-80℃長期保存（>5 年）。
 
                                                                無血清細胞凍存液
                                                                  貨號：CSP042
 
           
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