芯片點樣技術助力蛋白芯片尋找潛在的生物標志物
ArrayJet芯片點樣技術助力蛋白芯片尋找潛在的生物標志物
Andreas Weinhäusel，維也納自然資源與應用生命科學大學教授，同時在奧地利理工學院健康和生物資源中心從事分子診斷研究，于2022年3月對其研究進展進行了在線Webinar報告，內容涉及DNA甲基化以及自身抗體相關的生物標記物發(fā)現(xiàn)、生物傳感器研發(fā)、生物信息學分析、分子診斷等方面，充分利用高通量的蛋白芯片、多肽芯片這一技術手段。
Part 1 : ArrayJet高通量芯片點樣儀用于生物標志物的發(fā)現(xiàn)
分析臨床組織，血液，唾液等樣本中DNA、RNA以及蛋白的表達情況對預測疾病的發(fā)展階段，明確治療方向具有重要意義。其中DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、細胞癌變有著密切的聯(lián)系，多肽結構的異常也與許多心腦血管疾病息息相關，因此采取有效的研究方法在早期發(fā)現(xiàn)異常對于指導臨床方案具有重要意義。
例如使用甲基化生物芯片尋找潛在的生物標志物：首先樣本經(jīng)DNA甲基化修飾亞硫酸氫鹽處理，隨后進行全基因組甲基化篩選，通過生物信息學對甲基化位點進行分析并使用芯片點樣儀設計生物芯片找到潛在的生物靶點，采用Ion Torrent粒子流測序儀進行單細胞甲基化測序，后期使用甲基化敏感的限制性內切酶聯(lián)合PCR評估甲基化水平，采用cfDNA樣本進行結果驗證。
多肽生物芯片尋找疾病相關靶點：首先對感興趣的靶點進行生物信息學分析，通過芯片點樣儀把多種篩選的靶點設計成多肽芯片，對檢測結果進行生信分析，經(jīng)過廣泛的生物信息學篩選的基因特異的探針與磁珠連接，組裝成bead array芯片通過雙色熒光染色檢測出標記的核苷酸，結果采用ELISA實驗進行驗證。
Part 2：
IgG抗體在免疫應答中起著激活補體，中和多種毒素的作用，同時也是體液免疫應答的主要抗體，親和力高，體內分布廣泛，檢測IgG抗體的表達水平對于評估是否存在細菌和病毒感染，疾病發(fā)展狀態(tài)至關重要。
例如尋找與結腸癌相關的標志物：使用健康和結腸癌患者的血清對16k（一張芯片上至少包含16000種人類蛋白）蛋白芯片進行孵育，通過生物信息學分析和篩選找到疾病的相關靶點，使用芯片點樣儀將相關蛋白靶點設計成多肽芯片，孵育對照和患者血清進行結果篩選，通過抗IgG熒光二抗進行信號分析，結果使用bead array方法進行結果驗證。
該技術可應用在過敏原篩查，自身免疫疾病，癌癥，感染疾病相關標志物的尋找和發(fā)現(xiàn)等領域。
Part 3:
ArrayJet高通量芯片點樣儀在基于抗體的診斷技術中發(fā)揮通量高的特點，自身免疫抗體在腫瘤早期的無癥狀階段以及自身免疫疾病、神經(jīng)退行性疾病中存在明顯的表達差異，采用AIT蛋白芯片可以發(fā)現(xiàn)相關的抗原標志物。
ArrayJet高通量芯片點樣儀在基于抗體的診斷技術中發(fā)揮通量高的特點，自身免疫抗體在腫瘤早期的無癥狀階段以及自身免疫疾病、神經(jīng)退行性疾病中存在明顯的表達差異，采用AIT蛋白芯片可以發(fā)現(xiàn)相關的抗原標志物。
AIT蛋白芯片制備：15286個全長人cDNA片段，使用His標簽和鎳柱進行純化富集，純化后在玻片進行高密度點樣（32000個點/片），點樣體系（10-30ul/點）。后期檢測：孵育病人和正常人的血清，采用抗人的lgG熒光二抗進行標記，通過生物信號分析找到潛在的生物標志物。
采用生物芯片技術進行高通量篩選，對于尋找潛在抗原標志物、醫(yī)藥研發(fā)、臨床診斷有重要意義。
Part 4: IgG抗體孵育與血清孵育相比，可以提高檢測效率和檢測靈敏度
IgG抗體純化的標準化流程：
在EP管中加入15ul血漿或血清，再加入500ul凝膠進行離心，使用純化buffer清洗凝膠兩次，對血清采用純化buffer進行稀釋，加入含有抗體的溶液，上下充分混合，離心收集富集的抗體，對樣品質控150kD處含有均一的IgG抗體條帶，使用純化后的抗體對芯片進行孵育篩選相關靶點。
Part 5: ArrayJet高通量芯片點樣儀用于病原體蛋白芯片制備
病原體分泌蛋白對血清的反應性對于明確感染類型，控制病情惡化十分必要。
病原體生物芯片研究方法：案例樣本來自于254種細菌菌株，其中臨床分離株 239種，乳酸桿菌 15種，除此之外還有黃曲霉菌3種，念球菌3種。使用芯片點樣儀將樣本點印在環(huán)氧樹脂包被的玻片上，孵育血漿，找到IgG抗體特異性菌株。
總 結：
自身免疫抗體/免疫學研究方法的建立
- 首先可通過16kd蛋白芯片或多肽芯片進行標志物篩選，
- 篩選的靶點通過高通量點樣儀設計成生物微芯片
- 最后進行生物信息學分析找到潛在的標志物
Webiniar鏈接：
https://www.arrayjet.co.uk/resources/microarray-webinars
Arrayjet位于英國愛丁堡，專注于提供生物芯片應用領域的解決方案及服務。自2000年公司成立即致力于開發(fā)新型生物樣品噴點方案–噴墨式液體處理平臺，該系統(tǒng)于2005年上市，目前用戶遍布全球25個國家。
Mercury系列產品采用獨特的飛行噴墨點樣技術實現(xiàn)行業(yè)第一的快速、非接觸式微量液體處理。同時上萬種不同樣品可以進行快速點樣，專利的上樣模塊配合高通量的點樣噴頭保障您的點樣操作快速、無污染，更低的上樣體積可有效減少樣品損失，使您的珍貴樣品物盡其用。
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