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助力分子生物學研究的數字PCR技術介紹與應用

瀏覽次數：1908　發(fā)布日期：2022-10-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

　分子生物學作為一門新興的邊緣學科，它的迅速發(fā)展及其在整個生命科學領域的廣泛滲透和應用，促使人們對生物體的認知已經逐漸深入到微觀水平。從單個的生物體到器官、組織、細胞，再從細胞結構到核酸和蛋白的分子水平，人們意識到可以通過檢測分子水平的線性結構(如核酸序列)，來橫向比較不同物種，同物種不同個體，同個體不同細胞或不同生理狀態(tài)的差異。在醫(yī)學領域，分子生物學為醫(yī)學診斷、治療及新的疫苗、新藥物研制等開辟了新的途徑，使醫(yī)學科學中原有的學科發(fā)生分化組合，醫(yī)學分子生物學等新的學科分支不斷產生，使醫(yī)學科學發(fā)生了深刻變革。

　　分子生物學技術問世于20世紀80年代中期。這種以核酸、蛋白質等生物大分子為研究對象的新技術自發(fā)現(xiàn)以來，已經逐步成為醫(yī)學領域不可或缺的研究手段之一，利用分子生物學技術研究人體內源性或外源性生物分子的存在、結構或表達調控變化，為疾病研究以及進一步的預防、預測、診斷、治療、預后和轉歸提供信息和決策依據。其中，在精準醫(yī)療以及新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下，分子診斷學技術得到了近一步應用，也為分子生物學發(fā)展提供了新的機遇。

　　目前常見的分子診斷技術主要為熒光定量PCR技術(qPCR)、高通量測序技術(NGS)，數字PCR (digital PCR, dPCR) 是繼一代普通PCR、二代熒光定量PCR之后的第三代PCR技術，其具有高敏感度、絕對定量、高特異性、使用標本用量少等特點，在科研領域迅速得到廣泛應用，是科研領域新一研究利器!

　　在定量PCR時，我們常常糾結一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢?現(xiàn)在我們再也不需要去糾結這個問題了，因為數字PCR幫我們解決了。

　　數字PCR技術介紹

　　數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法，其中，光度法基于核酸分子的吸光度來定量，實時熒光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值(可以檢測到熒光值對應的循環(huán)數)，數字PCR是全新的定量技術，基于單分子PCR方法來定量核酸，是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化的方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片內數萬個微反應器或微滴中，每個反應器包含或不包含一個或多個拷貝的目標分子，從而實現(xiàn)”單分子模板PCR擴增”，擴增結束后含有核酸分子模板的微滴會給出熒光信號，最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，通過分析軟件計算給出目的分子的濃度或拷貝數。

　　數字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測;此外，由于數字PCR在進行結果判讀時僅需判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高;數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度。

　　那么，數字PCR可以幫助我們解決哪些科研難題呢?

　　數字PCR助力基礎科研

　　(1)基因表達差異研究

　　基因的差異化表達由多種因素共同導致，并且與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系，對差異化表達的基因進行生物信息學以及生物統(tǒng)計學的分析對于研究細胞調節(jié)機制和疾病機理有著重要意義。

　　實時熒光定量PCR 常用于檢測基因表達差異，但該方法一般只能檢測出兩倍或者更大的差異。而多數科學研究則需要檢測更為微小的表達變化。數字PCR由于檢測時完全不依賴傳統(tǒng)的Ct值即可實現(xiàn)真正意義上的絕對定量，從而提供了比實時熒光定量PCR更精確的基因差異表達研究，尤其對于那些靶基因表達差異微小的情況：microRNA、lncRNAs等的表達分析、等位基因的不平衡表達、單細胞基因表達分析、Exosome內核酸分子定量分析等。

　　(2)拷貝數(CNV)研究

　　CNV，即拷貝數變異(Copy number variation, CNV)，是由基因組發(fā)生重排而導致的，一般指長度為 1 kb 以上的基因組大片段的拷貝數增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復。CNV對于物種特異的基因組構成、物種的演化和系統(tǒng)發(fā)育以及基因組某些特定區(qū)域基因的表達和調控可能具有非常重要的生物學意義。

　　通常拷貝數分析依賴于瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光定量PCR 等方法，但該種方法拷貝數的確定總是受到限制。其中，傳統(tǒng)實時熒光定量PCR平臺可以鑒別低拷貝數 (如0至5的拷貝數)，但更高的拷貝數需要更精確的測量。dPCR通過直接計數目標基因和參照基因的雙重反應，通過計算比值，可直接得到目標基因的拷貝數，適用于更高拷貝數分析，檢測精度超過±10%。

　　(3)低豐度DNA模板分子的精確定量

　　目前對于低豐度目標序列的檢測，定量PCR、雜交、毛細管測序及NGS等方法都因受到背景DNA的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精細定量的要求(如定量PCR檢測中Ct值大于33的情況下，其重復性就不是很高)，而數字PCR系統(tǒng)通過稀釋樣品DNA到對應的數萬個檢測孔中，使得稀有的核酸序列從大量的背景DNA中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及重復性。此外，也將樣品中可能存在的抑制劑進行了分裝，提高了數字PCR擴增對于抑制劑的耐受程度，因此可具體應用于很多臨床樣品(血液、尿液、糞便、痰液、腦脊液等)中對腫瘤核酸標記物的檢測。一般而言，毛細管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約在10%;NGS的靈敏度可達到1%;而ddPCR的檢測下限為0.001%，適用于低豐度DNA模板分子的精確定量。

　　(4)甲基化含量鑒定

　　作為表觀遺傳學研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術來進行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序統(tǒng)計法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等。這些方法皆因方法學的問題而不能獲得精確的定量，而數字PCR系統(tǒng)通過對樣品的微滴化處理及目標因子的絕對拷貝數定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種全新的技術。

　　Dawne N1等人使用數字PCR進行DNA甲基化的檢測。結果顯示，數字PCR方法可檢出低至0.5%的SNRPN啟動子甲基化，其線性R2可達到0.9903，且將ddPCR結果與NGS檢測結果對比，一致性強，所用DNA量更少。Liesbeth Van Wesenbeeck2等人使用ddPCR和qPCR做DNA甲基化線性檢測時，對比結果顯示，在檢測低拷貝DNA時，ddPCR準確性較qPCR更高。

　　(5)CRISPR-Cas9基因編輯結果驗證

　　CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)，規(guī)律間隔成簇短回文重復序列，是一種RNA引導的基因組編輯技術，能對基因進行精確性敲除、敲入、替換等，從而實現(xiàn)探究基因功能,修復致病基因等目的。但是，CRISPR技術也會導致有潛在危險的“脫靶”問題，帶來不可預測的基因變化，因此對于CRISPR基因編輯的脫靶情況需要靈敏且精準的驗證及檢測。

　　目前有幾種方法可供選擇，其中新一代測序技術當然是金標準，但對于許多實驗室而言仍然是高不可攀的，對于小型項目來說也是不切實際的。數字PCR技術可以滿足這一需求。歐洲分子生物學實驗室研究人員Moritz Kueblbeck開發(fā)了一種聯(lián)合熒光標記蛋白和數字PCR的新方法，精準快速地實現(xiàn)了對基因編輯后的目的基因篩選，該方法大大地降低了檢測的人力、物力和成本。

　　展望

　　總而言之，由于數字PCR具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，目前已迅速得到廣泛的應用研究，其中這項技術在極微量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可，而在基因表達研究、拷貝數鑒定、甲基化含量鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經受到越來越多的關注。

　　但截止目前而言，數字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數字PCR的應用前景時，更應該保持一種開放的心態(tài)，與其說數字PCR技術是一個新的研究利器，不如把它視為一種全新的技術思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應用幫助我們深入到分子生物學研究的更高層次。

　　參考文獻：

　　Dawne Shelton, et al. “AACR 2014 - Cross Validation of NGS methylated targets using ddPCR”.

　　Liesbeth Van Wesenbeeck, et al. “Droplt digital PCR is an accurate method to assess methylation status on FFPE samples”. Epigenetics. 2018; 13 (3): 207–213.

　　焱伯數字PCR平臺助力科學研究

　　焱伯數字PCR采用MEMS工藝打造的納米級微流控芯片，可將樣本通過芯片微流道分散到數萬個反應單元中，對每個反應單元進行獨立的擴增與熒光信號的檢測，對反應體系中的靶標進行絕對定量。同時，焱伯數字PCR平臺秉持精密小巧工具化理念，讓更多科研用戶能在日常工作情境中輕松試用，使它成為有效的檢測工具。