無血清化學成分限定培養(yǎng)基開發(fā)與293細胞應(yīng)用方向

攻克原料組分化學成分難題，實現(xiàn)生物制藥病毒載體高表達

引言
1955年Eagle博士發(fā)布細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，并首次指出培養(yǎng)基是“一個包含無機鹽、氨基酸、糖、維生素及其他必須營養(yǎng)物的等滲透壓且具有pH緩沖能力的混合物”；1959年Eagle博士進一步改善了該配方，并將其命名為“Minimal Essential Medium (MEM)”。MEM培養(yǎng)基需要牛血清（10%以上）才能夠發(fā)揮作用。這在細胞培養(yǎng)基的研發(fā)歷史上，也是劃時代的里程碑事件！
 

無血清、化學成分限定培養(yǎng)基開發(fā)意義

當前，市場上做培養(yǎng)基的企業(yè)五花八門，既能保證細胞培養(yǎng)數(shù)量，又能保證細胞培養(yǎng)活力的培養(yǎng)基也有一些，但是大多含有血清，而這對于細胞成藥化和細胞大批量培養(yǎng)而言，又成為了一個巨大的門檻。如果細胞培養(yǎng)基含有外源血清的話，這對于后期的藥物申報會帶來不利影響。因為大批量培養(yǎng)的細胞，如果外源血清引入了病毒污染的話，這對企業(yè)將會帶來嚴重的質(zhì)量事故，所以，無血清培養(yǎng)基的開發(fā)已經(jīng)成為了細胞藥物研發(fā)企業(yè)和細胞庫運營企業(yè)亟需解決的重大挑戰(zhàn)！

無血清、化學成分限定的細胞培養(yǎng)基優(yōu)勢有：第一、增加確定性。生物實驗往往需要追根溯源，化學組分的限定能夠增加試驗的確定性，從而更受歡迎。第二、性能更一致。通過確定的配方，可以使每批產(chǎn)品質(zhì)量得到保障，性能更一致。第三、容易進行純化和下游加工。部分含血清的培養(yǎng)基，純化工藝較為復(fù)雜。第四、提高制品穩(wěn)定性。成分的確定為培養(yǎng)基的儲存、運輸條件、保質(zhì)期限帶來便利，提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性。多方面的優(yōu)勢，使得無血清、化學成分限定的培養(yǎng)基將成為未來主流的培養(yǎng)基。
 

293細胞應(yīng)用領(lǐng)域

復(fù)雜的生物制藥產(chǎn)品生產(chǎn)嚴重依賴于哺乳動物細胞系，而HEK293因其高轉(zhuǎn)染率和在無血清懸浮培養(yǎng)環(huán)境中快速生長能力而被廣泛應(yīng)用。主要體現(xiàn)在三個熱門方向：
①重組蛋白的生產(chǎn)。293真核表達系統(tǒng)可用于生產(chǎn)具有復(fù)雜翻譯后修飾的重組蛋白，生物活性更接近天然蛋白。
②病毒載體生產(chǎn)。HEK293常用于病毒載體的生產(chǎn)，由于在病毒載體生產(chǎn)過程中存在提供輔助功能的腺病毒E1A/B基因，因此將其用于腺病毒和腺相關(guān)病毒載體的生產(chǎn)，并且懸浮培養(yǎng)更能提高產(chǎn)量。
③腺病毒載體疫苗和溶瘤腺病毒的生產(chǎn)。由于AdVs和AAVs的產(chǎn)生需要HEK293細胞中腺病毒E1基因的反式互補，而人胚胎腎細胞HEK293又具有穩(wěn)定生長，高表達滴度病毒的優(yōu)勢，故HEK293細胞成為其選擇對象之一，以獲得較高的病毒滴度。

293細胞是腺病毒載體的包裝細胞，腺病毒是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒和轉(zhuǎn)座子等用于細胞治療基因修飾的熱門載體。由于直接將腺病毒載體導(dǎo)入人體內(nèi)表達目的基因，從而可以治療惡性腫瘤、心血管疾病及一些遺傳疾病。利用腺病毒載體在包裝細胞293中表達分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸、激酶IC等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的其中一種途徑。
 

293細胞作用機理及培養(yǎng)手段

人胚胎腎細胞293的商品名為HEK293細胞，是一個由人胚胎腎細胞的細胞系傳代培養(yǎng)而來，目前在全球范圍內(nèi)廣泛使用的一種經(jīng)典細胞系，具有轉(zhuǎn)染效率高，易于培養(yǎng)等優(yōu)點。經(jīng)過多年的傳代培養(yǎng)以后，它可細分為好幾種衍生株，其中293T/17細胞株的轉(zhuǎn)染效率更好，因此它也成為廣大科研工作者研究基因功能的常用工具。

293T細胞是293細胞通過基因技術(shù)派生出的細胞系，是經(jīng)過腺病毒E1A基因的轉(zhuǎn)染，能表達SV40大T抗原，含有SV40復(fù)制起始點與啟動子區(qū)。許多真核表達載體如pcDNA3.1中含有SV40病毒的復(fù)制起始位點，可以在表達SV40病毒T抗原的細胞系中復(fù)制，從而提高外源基因的表達水平。因此293T細胞廣泛應(yīng)用于病毒包裝，并且添加磷酸鈣以后能將轉(zhuǎn)染效率提高50%以上。在蛋白表達水平高的情況下，轉(zhuǎn)染后2-3天就可以通過堿性磷酸酶分析檢測到表達的蛋白。瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞是過表達蛋白并獲得細胞內(nèi)及細胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。293細胞在培養(yǎng)過程中的缺陷是生長過程中貼壁強度較少，在實驗過程中非常容易流失，從而影響實驗結(jié)果。因此，完善293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)具有越來越重要的意義。哺乳細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式大致分為三種：貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)以及無血清懸浮培養(yǎng)。它在無Ca²⁺或含Ca²⁺培養(yǎng)基中及血清濃度降低的培養(yǎng)基中亦可同樣生長。如果一個實驗室所得到的293細胞是通過郵寄的方式獲取，并且細胞是存活在培養(yǎng)瓶中的情況。這就需要讓293細胞靜置一段時間，降低漂浮在培養(yǎng)液的細胞數(shù)量。

無血清懸浮培養(yǎng)作為一種人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，因此該方法正逐步成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。要實現(xiàn)293細胞無血清懸浮培養(yǎng)必須先將貼壁培養(yǎng)293馴化為懸浮培養(yǎng)293S細胞并尋找適合高密度無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)液配方。懸浮培養(yǎng)時，由于缺少血清和蛋白的保護作用，293S對剪切力的敏感度增加，難以達到高密度培養(yǎng)，導(dǎo)致293S產(chǎn)生病毒的數(shù)量比貼壁培養(yǎng)低5-10倍左右。細胞接種后，灌流培養(yǎng)7天，達到細胞密度5×10⁶/ml，即可實現(xiàn)增殖5-10倍。
 

AMMS^® HEK293無血清培養(yǎng)基

隨著生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和生命科學基礎(chǔ)研究對動物細胞培養(yǎng)規(guī)模、效率和安全性能要求的不斷擴大和提高，對生產(chǎn)過程中培養(yǎng)基的使用要求越來越高。大部分生物制藥是利用哺乳動物細胞生產(chǎn)的，細胞培養(yǎng)技術(shù)是生物制藥生產(chǎn)工藝的核心技術(shù)，而細胞培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，是生物制藥生產(chǎn)的關(guān)鍵原材料之一。人胚腎細胞系HEK293及其衍生細胞系，如293T細胞，293A細胞，293E細胞，293FT細胞等，被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，已成為一種強大的載體和新的平臺，用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)、基因治療的病毒載體、溶瘤細胞藥物、病毒樣顆粒疫苗、病毒載體疫苗等，而在細胞培養(yǎng)中化學成分限定的無血清培養(yǎng)基則是實際生產(chǎn)應(yīng)用的首選。化學成分限定培養(yǎng)基有利于進行細胞培養(yǎng)的代謝及調(diào)控研究，也是工業(yè)生產(chǎn)抗體和重組蛋白的主流培養(yǎng)基。

一款真正化學成分限定培養(yǎng)基
同立海源AMMS^® HEK293無血清培養(yǎng)基是一款用于 HEK-293 類細胞懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染過程的無血清、無蛋白、無動物源的化學成分限定培養(yǎng)基。產(chǎn)品中含有 HEPES、碳酸氫鈉、氨基酸、維生素、酚紅、微量元素、PluronicÒ F-68 等有利于 HEK293 類細胞 生長和表達的組分。產(chǎn)品在使用前需加入 L-谷氨酰胺一起使用。具有為廣大客戶增加實驗確定性、性能更一致等多方面的優(yōu)勢！
 

圖1：細胞生長曲線對比測試
 

圖2：細胞活率曲線對比測試

圖3：不同抗體及蛋白表達對比

細胞培養(yǎng)基是以動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)為技術(shù)平臺，研發(fā)及生產(chǎn)生物藥品的關(guān)鍵原材料之一。生物工藝中細胞培養(yǎng)基的選擇要兼顧培養(yǎng)基使用性能、監(jiān)管合規(guī)、供應(yīng)安全、下游純化工藝易行性及經(jīng)濟成本等多層面要求。另外不管是選取哪種培養(yǎng)方式，最重要的一點是注意無菌操作，防止污染。其次在選擇293細胞適合的培養(yǎng)方式以及有利于其生長的培養(yǎng)基后，對細胞生長狀況實行有效監(jiān)控，以便獲得穩(wěn)定的蛋白或病毒產(chǎn)物。