高通量單B細(xì)胞篩選技術(shù)及解決方案

抗體（antibody）是指機(jī)體因抗原刺激而產(chǎn)生的具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。其中利用分子生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)，用于疾病或病毒感染治療的抗體，被稱為抗體藥物�？贵w藥物，具有直擊腫瘤特異性抗原、高特異性、低不良反應(yīng)和療效確切等特點(diǎn)，在腫瘤、自身免疫、代謝、病毒感染等疾病領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，是目前最大的治療用生物劑類別。
 
單克隆抗體作為抗體藥物的先行者，在全世界十大用藥里面有 7 個(gè)是單抗藥，已經(jīng)在多個(gè)治療領(lǐng)域展現(xiàn)出其獨(dú)特的治療價(jià)值�？贵w藥物在研發(fā)周期上跟小分子藥物相比也有所縮短，市場(chǎng)需求亦逐年擴(kuò)容，逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。并且隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展及對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能不斷深入認(rèn)識(shí)，研究人員通過不同抗體片段的組合、對(duì)抗體表面的位點(diǎn)進(jìn)行修飾、偶聯(lián)小分子藥物或其他化學(xué)物質(zhì)等策略，發(fā)展了數(shù)量龐大的抗體結(jié)構(gòu)形式，并各有優(yōu)勢(shì)。包括抗體融合蛋白 、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）、雙特異性抗體（BsAb）、小分子抗體片段等。從目前的研發(fā)流程來看，這些其他類別的抗體藥物也是從單克隆抗體發(fā)現(xiàn)開始。另外在細(xì)胞治療領(lǐng)域，細(xì)胞治療相關(guān)的 CAR-T 和 CAR-NK 的 CAR 候選分子開發(fā)需要對(duì)單克隆抗體與抗原結(jié)合的親和力進(jìn)行篩選，研發(fā)起點(diǎn)同樣始于單克隆抗體發(fā)現(xiàn)。以上生物治療相關(guān)的產(chǎn)品開發(fā)，從研發(fā)流程來看，都起始于單克隆抗體發(fā)現(xiàn)�？梢妴慰寺】贵w市場(chǎng)需求容量龐大，因此單克隆抗體篩選技術(shù)的迭代亦備受矚目，發(fā)展也是日新月異。
 
單克隆抗體發(fā)現(xiàn)
目前，單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的技術(shù)主要有雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)和單 B 細(xì)胞篩選技術(shù)。其中單 B 細(xì)胞篩選技術(shù)因?yàn)槠溲邪l(fā)周期短而備受矚目。 雜交瘤技術(shù)：可篩選出無(wú)限增殖并分泌抗體的雜交融合細(xì)胞，用于穩(wěn)定生產(chǎn)具有天然活性的單克隆抗體。但通常制備需 5-6 個(gè)月，且得到的抗體免疫原性高、半衰期短、批間差異大，其次融合效率低，易丟失抗體的多樣性，不利于新抗體的發(fā)現(xiàn)。  
噬菌體展示技術(shù)：將抗體 DNA 序列插入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因適當(dāng)位置，抗體隨噬菌體組裝展示于噬菌體表面。該技術(shù)無(wú)需 B 細(xì)胞培養(yǎng)過程，但是抗體未經(jīng)過體內(nèi)成熟過程，抗體序列往往親和力有限，特異性差，重鏈和輕鏈的隨機(jī)組合，使得抗體重鏈輕鏈無(wú)法保持天然配對(duì)。  
單 B 細(xì)胞篩選技術(shù)：是近年來新興的單抗發(fā)現(xiàn)技術(shù)，其將單細(xì)胞分離鑒定技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，獲得單個(gè) B 細(xì)胞抗體基因并進(jìn)行體外克隆和表達(dá)，獲得的抗體保證了輕重鏈可變區(qū)的天然配對(duì)，相較于傳統(tǒng)的抗體制備技術(shù)，具有效率高、全人源、基因多樣性豐富、細(xì)胞數(shù)量少、周期短、適用于任意動(dòng)物抗體篩選等優(yōu)點(diǎn)。因可直接獲得抗體基因序列，方便下游抗體工程改造，在抗體藥物研發(fā)、快速應(yīng)對(duì)病原微生物傳染病方面具有巨大優(yōu)勢(shì)，是免疫診斷試劑和治療藥物開發(fā)的理想選擇。

 單克隆抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)方法總結(jié)對(duì)比 

 
單 B 細(xì)胞篩選技術(shù)
基于單 B 細(xì)胞篩選技術(shù)有諸多優(yōu)勢(shì)但存在抗原特異性細(xì)胞比例低的特點(diǎn)，需要借助高通量及高靈敏的分選系統(tǒng)對(duì)少量的特異性 B 細(xì)胞進(jìn)行富集，目前用于單 B 細(xì)胞抗體篩選技術(shù)主要有液滴微流控技術(shù)、微孔/微腔室技術(shù)和流式細(xì)胞分選技術(shù)。 液滴微流控是近年來微流控領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展分支，該技術(shù)將每一個(gè)微液滴視為一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)器，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的反應(yīng)檢測(cè)與篩選�；�于液滴微流控的分選技術(shù)，具有通量高、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，在單 B 抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域具有巨大潛力。而目前，成熟商業(yè)化的儀器平臺(tái)仍然較少，存在較大的未被滿足的需求。
基于微孔/微腔室技術(shù)的單 B 細(xì)胞分選，其先將細(xì)胞導(dǎo)入微孔小室，之后再導(dǎo)入檢測(cè)試劑，基于熒光信號(hào)分選陽(yáng)性細(xì)胞，可通過抗原特異性檢測(cè)，分選出分泌型功能漿 B 細(xì)胞，單張芯片可實(shí)現(xiàn) 1-2w 個(gè)細(xì)胞評(píng)估分選，解決了單細(xì)胞分離和單細(xì)胞篩選問題，但篩選通量有限，且商業(yè)化的儀器成本和單次運(yùn)行成本都非常昂貴，引入門檻過高，整體市場(chǎng)占有率較低。 
而流式細(xì)胞技術(shù)，基于細(xì)胞表面或胞內(nèi)標(biāo)志物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，無(wú)法基于細(xì)胞分泌的蛋白進(jìn)行分選，因此只適合于記憶型 B 細(xì)胞的分選，無(wú)法直接對(duì)分泌抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè)，存在后期工作量大、成本高、靈敏度低、假陽(yáng)性率高等局限性。
液滴微流控是近年來微流控領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展分支，該技術(shù)將每一個(gè)微液滴視為一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)器，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的反應(yīng)檢測(cè)與篩選�；�于液滴微流控的分選技術(shù)，單次實(shí)驗(yàn)可以處理 106 個(gè)漿 B 細(xì)胞，且使用的耗材設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈成熟。整體來說，具有通量高、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。在單 B 抗體發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域具有巨大潛力。但目前，成熟商業(yè)化的儀器平臺(tái)仍然較少，市場(chǎng)潛力有待鋪墊。
Comet 彗星高通量單細(xì)胞篩選系統(tǒng)以微液滴作為單 B 細(xì)胞檢測(cè)的反應(yīng)單元，實(shí)現(xiàn)功能性單 B 細(xì)胞的高通量篩選。 
1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法選擇：選擇合適的方法學(xué)：磁珠法檢測(cè)或 FRET 法檢測(cè)。
2）細(xì)胞包裹：使用液滴生成系統(tǒng)將功能性熒光檢測(cè)試劑與 B 細(xì)胞包裹成微液滴。
3）液滴孵育和抗體分泌：這個(gè)過程中，微液滴中單個(gè) B 細(xì)胞能夠產(chǎn)生和分泌一定量的單克隆抗體，抗體與液滴中 B 細(xì)胞功能檢測(cè)試劑反應(yīng)并產(chǎn)生熒光信號(hào)。
4）目標(biāo)B細(xì)胞篩選：使用彗星高通量篩選系統(tǒng)，檢測(cè)液滴中反應(yīng)后的熒光信號(hào)，對(duì)陽(yáng)性液滴細(xì)胞進(jìn)行高通量分選富集。單次可實(shí)現(xiàn)百萬(wàn)級(jí)別單 B 細(xì)胞的篩選。
5）BCR測(cè)序：篩選后的陽(yáng)性 B 細(xì)胞可進(jìn)行低通量的 RT-PCR 后接測(cè)序從而獲取 BCR 序列。亦可直接在達(dá)普自主開發(fā)的 Galaxy 單細(xì)胞建庫(kù)系統(tǒng)進(jìn)行高通量單細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建。
6）目標(biāo) VH - VL 序列獲取：高通量測(cè)序后，獲得單 B 細(xì)胞的 BCR 序列，通過自主開發(fā)的 StarScope 生信分析軟分析拼接，最終獲得輕重鏈配對(duì)的抗體序列，用于后期載體構(gòu)建及表達(dá)。