單細(xì)胞分選技術(shù)在B.SIGHT高效分離厭氧腸道細(xì)菌的應(yīng)用

腸道微生物群及其研究的重要性
腸道微生物群是指存在于胃腸道中的多樣化微生物群落，它們?cè)谡{(diào)節(jié)宿主健康中起著關(guān)鍵作用�，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，腸道微生物群的結(jié)構(gòu)和功能變化與多種慢性疾病的發(fā)展息息相關(guān)，如代謝性疾病、炎癥性腸病和結(jié)直腸癌。因此，研究這些微生物群落的遺傳多樣性具有重要意義。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，科學(xué)家們揭示了許多未知微生物的存在，反映出腸道微生物群的復(fù)雜性。然而，盡管測(cè)序技術(shù)提供了大量信息，基于培養(yǎng)的研究依然至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈儾粌H有助于正確分類和描述新微生物，還為后續(xù)的功能研究提供了可能。
 
腸道微生物分離與培養(yǎng)的挑戰(zhàn)
在從復(fù)雜菌落中分離和描述微生物的過(guò)程中，高效分離單個(gè)菌落成員以生成無(wú)菌培養(yǎng)物是一個(gè)重要步驟。由于人類糞便中的微生物群分布不均，這一過(guò)程變得更加復(fù)雜。獲得純培養(yǎng)物的傳統(tǒng)方法主要依賴于瓊脂平板上的菌落劃線或連續(xù)稀釋過(guò)程。在連續(xù)稀釋方法中，樣品在微孔板中連續(xù)稀釋，直到?jīng)]有觀察到細(xì)菌生長(zhǎng)。雖然這種方法可以產(chǎn)生純培養(yǎng)物，但由于只有一小部分孔能夠產(chǎn)生微生物培養(yǎng)物，因此效率低且產(chǎn)量有限。所以，改進(jìn)從復(fù)雜基質(zhì)中分離單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)，對(duì)于提高培養(yǎng)方法的效率至關(guān)重要。
 
B.SIGHT：一種高效的單細(xì)胞分離方法
為了解決上述問(wèn)題，我們?cè)诖私榻B一種快速生成腸道細(xì)菌無(wú)菌培養(yǎng)物的簡(jiǎn)化工作流程。繞過(guò)低效的有限稀釋步驟，我們采用專為快速分選單個(gè)微生物細(xì)胞并直接生成克隆培養(yǎng)物而設(shè)計(jì)的B.SIGHT系統(tǒng)。B.SIGHT可以將單個(gè)微生物細(xì)胞分離到液體培養(yǎng)基或固體瓊脂上。這種臺(tái)式的系統(tǒng)也可放置在厭氧工作站中，非常適合處理厭氧菌。
  我們使用B.SIGHT系統(tǒng)，成功獲得了1181個(gè)大腸桿菌和擬桿菌，以及1666個(gè)小鼠腸道細(xì)菌的克隆菌群。在最終培養(yǎng)物中，通過(guò)MALDI-TOF-MS鑒定了多達(dá)500個(gè)分離株，揭示了潛在的新物種的存在。此項(xiàng)研究不僅顯著提高了培養(yǎng)方法的效率，還為微生物分類和功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
 
#材料和方法
 
1. 樣品和培養(yǎng)條件
大腸桿菌和硫化桿菌菌株來(lái)源于內(nèi)部細(xì)菌收集。來(lái)自小鼠腸道的復(fù)合微生物群是由先前生成的混合培養(yǎng)物中獲取的。菌株和樣本在厭氧條件下（89.3% N2, 4.7% H2, 6% CO2）于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。然后將細(xì)胞分配到不同的培養(yǎng)基中（BHI，腦心浸液；WCA，Wilkins-Chalgren厭氧培養(yǎng)基；GMM，腸道微生物培養(yǎng)基）。所有材料和培養(yǎng)基在開(kāi)始分離工作前24小時(shí)放入?yún)捬豕ぷ髡尽?br />  
2. B.SIGHT單細(xì)胞分離原理
B.SIGHT專為快速、簡(jiǎn)單、溫和地分離單菌株而設(shè)計(jì)，能夠利用高分辨率成像技術(shù)進(jìn)行微生物細(xì)胞分離。在實(shí)驗(yàn)中，樣本首先加載到一個(gè)墨盒中，然后進(jìn)入一個(gè)直徑為20 µm的噴嘴。當(dāng)壓電傳感器驅(qū)動(dòng)的活塞推動(dòng)硅膜時(shí)，分配芯片會(huì)迅速按需生成小液滴。在操作過(guò)程中，對(duì)分配芯片噴嘴區(qū)域連續(xù)成像。檢測(cè)軟件會(huì)自動(dòng)分析每個(gè)經(jīng)過(guò)的顆粒，確認(rèn)下一個(gè)液滴中是否包含符合參數(shù)的單個(gè)細(xì)胞，只有符合條件的細(xì)胞才會(huì)被分配到下方的96孔或384孔板的一個(gè)孔中。多余的液滴，如空液滴或包含多個(gè)細(xì)胞的液滴，在分配之前會(huì)被真空去除（圖2A）。每個(gè)被分配液滴在噴嘴區(qū)域采集的圖像都會(huì)自動(dòng)存儲(chǔ)，以便后續(xù)驗(yàn)證單細(xì)胞分離的準(zhǔn)確性（圖2B）。  
3. 微生物單細(xì)胞分離的工作流程
工作流程如圖3所示。在細(xì)胞分離之前，將單個(gè)細(xì)菌菌株或混合菌群在厭氧條件下的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，以獲得不含腸道內(nèi)容物碎片且具有足夠密度的細(xì)胞懸浮液。接著，將這些培養(yǎng)物在補(bǔ)充有0.5%（w/v）蛋白胨和還原劑的過(guò)濾滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中進(jìn)行逐級(jí)稀釋。最終稀釋液通過(guò)10μm膜過(guò)濾，并分配（50-70μl）到帶有20μm噴嘴的無(wú)菌墨盒中，安裝在B.SIGHT儀器上以進(jìn)行單細(xì)胞分配。B.SIGHT儀器的準(zhǔn)備時(shí)間通常為5-10分鐘。單細(xì)胞被分配到裝有液體或瓊脂培養(yǎng)基的96孔板中。分配后，樣品在37℃下孵育1至7天。液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物隨后轉(zhuǎn)移到瓊脂板上進(jìn)行進(jìn)一步分析。  
4. MALDI-TOF-MS細(xì)菌鑒定
將待鑒定的每個(gè)細(xì)胞菌落直接點(diǎn)到MALDI靶標(biāo)上，每個(gè)樣本加1μl α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)溶液，并在室溫下干燥。最后使用Microflex LT質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics，Germany）進(jìn)行MALDI-TOF測(cè)量。
 
# 結(jié)果和討論
 
1. 單一菌株的克隆培養(yǎng)物
本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估單個(gè)菌株（每個(gè)孔理論上包含一個(gè)細(xì)胞）在孔板中生長(zhǎng)的比例。實(shí)驗(yàn)采用了兼性厭氧菌種大腸桿菌和嚴(yán)格厭氧菌種B. vulgatus，以驗(yàn)證該方法對(duì)嚴(yán)格厭氧菌的適用性。在實(shí)驗(yàn)中，我們處理了10個(gè)96孔板，共獲得800個(gè)單細(xì)胞孔（每塊板的兩行孔保留為陰性對(duì)照：空液滴和培養(yǎng)基各保留一行）。通過(guò)OD600吸光度測(cè)量，確定了表現(xiàn)出生長(zhǎng)的孔的百分比。結(jié)果顯示，79.1±4.0%的孔對(duì)大腸桿菌呈陽(yáng)性，68.5±5.3%的孔對(duì)B. vulgatus呈陽(yáng)性（圖4a）。  
2. 從復(fù)雜小鼠腸道樣品中分離的單個(gè)細(xì)菌的鑒定
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)處理小鼠腸道復(fù)雜群落來(lái)評(píng)估其細(xì)菌多樣性。對(duì)于樣品1，將單細(xì)胞分配到六個(gè)固體瓊脂平板和九個(gè)液體培養(yǎng)平板上，共計(jì)1200個(gè)孔。克隆效率即生長(zhǎng)孔的比例，達(dá)到了87.6%（圖4a）。而樣品2，共使用七個(gè)固體瓊脂平板和三個(gè)液體培養(yǎng)平板，總計(jì)800個(gè)孔，單克隆比例為77.8%（圖2a）。孵育后，使用MALDI生物型測(cè)定技術(shù)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。樣品1的分析結(jié)果表明，經(jīng)處理的465個(gè)分離株中至少包含八個(gè)不同的物種（圖4b）。樣品2則揭示了620個(gè)分離株，至少分屬于12個(gè)物種（圖4b）。在兩個(gè)樣品中，均發(fā)現(xiàn)了與MALDI數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配的培養(yǎng)物，可能代表了小鼠腸道微生物群中的未知物種。
 
# 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本文介紹了一種高通量培養(yǎng)工作流程，能夠生成大量單克隆培養(yǎng)物用于下游鑒定。B.SIGHT系統(tǒng)在單細(xì)胞分配到液體培養(yǎng)基和固體瓊脂上的過(guò)程中表現(xiàn)出高度靈活性，并配備圖像確認(rèn)功能，使整個(gè)操作過(guò)程更加可靠和可控。
 
B.SIGHT系統(tǒng)占地面積小，能夠方便地放置在厭氧室和層流罩中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這進(jìn)一步增強(qiáng)了其應(yīng)用范圍和適應(yīng)性。利用B.SIGHT，已經(jīng)成功獲得了2800個(gè)單克隆的培養(yǎng)物。
 
盡管本文的研究重點(diǎn)是腸道微生物群，但通過(guò)適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)條件，這一方法也可以便捷地應(yīng)用于其他類型的微生物環(huán)境。因此，這種高通量培養(yǎng)工作流程被視為研究并培養(yǎng)復(fù)雜微生物種群快速且有效的方法，不僅提高了實(shí)驗(yàn)的效率和產(chǎn)出質(zhì)量，還為多種微生物的研究提供了強(qiáng)大工具，為相關(guān)科學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
 
B.SIGHT用戶案例
經(jīng)典的瓊脂平板（CAP）方法雖然廣泛用于研究微生物群落，但其耗時(shí)頗長(zhǎng)。相比之下，單細(xì)胞分配（SCD）方法則允許高通量、無(wú)標(biāo)記地分選微生物。德國(guó)亞琛工業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)借助B.SIGHT系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了一種新的厭氧SCD方案，用于培養(yǎng)人類腸道細(xì)菌，并通過(guò)糞便樣本在三種富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，與CAP方法進(jìn)行了對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新的厭氧SCD方法將單克隆培養(yǎng)物的獲得時(shí)間從17天縮短至5天，同時(shí)其分離細(xì)菌的多樣性和相對(duì)豐度在覆蓋率與CAP方法相當(dāng)。
 
此外，研究團(tuán)隊(duì)還測(cè)試了總捕獲部分，對(duì)2400個(gè)分配的單細(xì)胞在生長(zhǎng)后直接進(jìn)行測(cè)序，分析未標(biāo)識(shí)單個(gè)菌株的體積生物量。結(jié)果顯示，SCD方法的培養(yǎng)分?jǐn)?shù)從35.2%提升至52.2%，展示了單樣本在深層培養(yǎng)項(xiàng)目中的潛力�；�于SCD的培養(yǎng)還獲得了未檢測(cè)到的物種，每個(gè)樣本平均發(fā)現(xiàn)16種未知微生物，其中包括7個(gè)新分類群。
 
此研究覆蓋了5個(gè)門(mén)（放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、脫硫菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)）、24個(gè)科的82種人類腸道細(xì)菌，其中包含11個(gè)新屬和10個(gè)新物種的第一個(gè)培養(yǎng)菌。這為微生物培養(yǎng)和研究提供了新的視角和方法。  
未來(lái)展望
B.SIGHT技術(shù)在厭氧腸道細(xì)菌分離工作中帶來(lái)了革命性的變化。憑借其高效、精準(zhǔn)和高通量的特性，B.SIGHT不僅顯著提升了研究效率，還為合成生物學(xué)和微生物組學(xué)的研究開(kāi)辟了新的可能性。這一突破性工具無(wú)疑為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供了充分的便利和潛力。如果您也從事相關(guān)領(lǐng)域的研究，B.SIGHT絕對(duì)是您值得嘗試的強(qiáng)大工具。它不僅能加速您的研究進(jìn)展，還能為您提供更為精確和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
 
如果您想了解更多B.SIGHT技術(shù)的信息以及科研進(jìn)展，歡迎關(guān)注典奧生物科技公眾號(hào)，一起探索微生物世界的無(wú)限可能！