類(lèi)器官與PBMC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案及步驟

最近很多寶寶問(wèn)類(lèi)器官如何跟PBMC共培養(yǎng)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)還是要先養(yǎng)好類(lèi)器官，可以參照之前的類(lèi)器官原代培養(yǎng)篇 “ 類(lèi)器官原代培養(yǎng)全流程 ”。

圖1 基質(zhì)膠法構(gòu)建類(lèi)器官
 

那類(lèi)器官培養(yǎng)成功的標(biāo)準(zhǔn)是什么呢？首先是我們培養(yǎng)的類(lèi)器官需要穩(wěn)定傳代3代以上，才能表示其干性是比較好的，其次就是要經(jīng)過(guò)組化鑒定，觀(guān)察其和原組織形態(tài)和細(xì)胞類(lèi)型上是否保持一致。經(jīng)過(guò)鑒定后就可以進(jìn)入我們下一步的實(shí)驗(yàn)了，類(lèi)器官組化的方法跟我們常規(guī)組織操作方法是十分類(lèi)似的，區(qū)別就在于類(lèi)器官的固定上，操作方法小愛(ài)也給大家整理好了。詳見(jiàn)“類(lèi)器官實(shí)操大本營(yíng)之——固定包埋”
 

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圖2 類(lèi)器官組化鑒定

現(xiàn)在就進(jìn)入我們共培養(yǎng)環(huán)節(jié)啦！
 

1）提前一周，復(fù)蘇培養(yǎng)類(lèi)器官至狀態(tài)良好；

2）取合適數(shù)量類(lèi)器官，使用預(yù)冷PBS清洗數(shù)次，去除大部分基質(zhì)膠；

3）使用培養(yǎng)基重懸類(lèi)器官。
 

1）外周血在無(wú)菌環(huán)境下，使用添加EDTA-K2的真空采血管采集，運(yùn)輸保存；

2）酒精消毒采血管表面，在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)，將外周血轉(zhuǎn)入無(wú)菌15mL離心管；

3）使用Ficoll法分離PBMC；

4）PBMC計(jì)數(shù)，計(jì)算活力與與細(xì)胞數(shù)；

5）使用培養(yǎng)基（RPMI1640，10%FBS，1%雙抗，2mM谷氨酰胺，5ng/mL  IL-4與GM-CSF），懸浮調(diào)整至合適濃度，96孔板，每孔約加入5*105 活PBMC，100uL體積；

6）重懸類(lèi)器官混合液，分別加入等量的樣至96孔板中，至總體積200uL。
 

1）D0觀(guān)察記錄細(xì)胞狀態(tài)；

2）37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，每日連續(xù)觀(guān)察；

3）D3吸出100uL培養(yǎng)上清，加入100uL新培養(yǎng)基，同時(shí)加入（處理抗體或藥物）使至終濃度100nM（如果D3已出現(xiàn)顯著差別，則記錄大視野明場(chǎng)形態(tài)，終止實(shí)驗(yàn)）；

4）觀(guān)察至實(shí)驗(yàn)組間差異顯著，拍照記錄大視野細(xì)胞明場(chǎng)形態(tài)；

5）細(xì)胞上清保存用于后續(xù)檢測(cè)。
 

此圖為我司做得免疫共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，從上圖可明顯看出B藥物作用下，T細(xì)胞有明顯的殺傷效果。