項目文章：組蛋白磷酸化介導肝臟胰高血糖的糖異生程序以響應禁食

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肝糖異生失調(diào)導致I型和II型糖尿病的高血糖。肝糖異生被認為是在禁食狀態(tài)下維持血糖水平的主要事件。肝臟胰島素抵抗則是這類疾病發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié), 其最明顯的病理生理特點就是糖異生和糖原分解功能發(fā)生紊亂導致肝糖輸出增多, 其中糖異生的作用尤為顯著。

 

因此, 有效抑制肝臟過度糖異生, 減少內(nèi)源性葡萄糖生成, 將是治療糖尿病的重要靶標之一。盡管我們已經(jīng)清楚糖異生活性的調(diào)節(jié)在很大程度上依賴于轉(zhuǎn)錄水平，但是糖異生基因的轉(zhuǎn)錄激活的具體機制還未被闡明。

 

2023年3月1日，中國科學院上海營養(yǎng)與健研究所丁秋蓉團隊在Molecular Cell在線發(fā)表題為Histone phosphorylation integrates the hepatic glucagon-PKA-CREB gluconeogenesis program in response to fasting 的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了組蛋白磷酸化對激素信號有反應，并將信號傳遞給染色質(zhì)以激活糖異生基因。具體而言：在饑餓狀態(tài)下，胰高血糖素激活PKA信號通路，PKA隨即被CREB招募到基因組糖異生基因調(diào)控區(qū)域，磷酸化H3S28。14-3-3ζ識別H3S28ph信號并招募RNA聚合酶II激活糖異生基因轉(zhuǎn)錄。

 

總之，作者揭示了激素信號激活的轉(zhuǎn)錄因子途徑和染色質(zhì)調(diào)節(jié)模塊之間在控制代謝穩(wěn)態(tài)中的相互作用和合作的密切性質(zhì)，為糖尿病患者治療提供了新的理論框架。

 

中文標題： 組蛋白磷酸化結(jié)合肝臟胰島素-PKA-CREB介導的糖異生程序以響應饑餓

研究對象：小鼠肝組織，肝細胞

發(fā)表期刊：Molecular Cell

影響因子：19.328

發(fā)表時間：2023.3.1

合作單位：中國科學院上海營養(yǎng)與健康研究所

運用生物技術：RNA測序、CUT&Tag、ChIP-seq分析、4D-label free蛋白質(zhì)組(由鹿明生物提供技術支持)

研究思路

主要結(jié)果

1.H3S28ph可以顯著促進肝臟糖異生基因表達和糖異生

作者首先利用多種蛋白修飾抗體確認對禁食后組蛋白翻譯后修飾的影響，發(fā)現(xiàn)H3S28ph信號顯著增加，與肝臟CREB磷酸化的增加相當。

圖1 | 組蛋白H3S28被磷酸化以響應低糖信號

進一步，作者使用RNA測序、CUT&Tag和ChIP-seq分析，以評估禁食和喂食狀態(tài)下H3S28gh的RNA圖譜和位置的全基因組變化。糖異生基因是對禁食反應中上調(diào)最多的基因，在禁食誘導的基因附近可以清楚地看到H3S28ph的增加，以及葡萄糖異生基因（如G6pc、Fbp1、Pck1和Pcx）附近觀察到明顯的H3S28ph信號。這些結(jié)果表明H3S28ph是葡萄糖異生基因附近對禁食反應的顯性激活修飾。

圖2 | 組蛋白H3S28磷酸化定位在快速誘導基因附近

此外，通過肝臟特異過表達野生型H3.3（wt）和H3.3S28A（S28突變?yōu)楸�氨酸以阻斷磷酸化�?/span>和H3.3S28D（S28變異為天冬氨酸以模擬磷酸化），證明H3.3-S28D可以顯著促進肝臟糖異生基因表達和糖異生過程。

圖3 | 組蛋白H3S28磷酸化增強肝臟糖異生

2.14-3-3z識別H3S28ph并刺激肝臟糖異生基因轉(zhuǎn)錄

作者進一步探究優(yōu)先結(jié)合H3S28ph并介導基因表達激活的因素。通過蛋白質(zhì)組學鎖定核定位增加的蛋白，并結(jié)合cut-tag確定14-3-3z信號在糖異生基因的顯著富集，其分布模式與H3S28ph的信號幾乎相同。Co-IP實驗表明，內(nèi)源性14-3-3z與肝組織中的RNA Pol II及其磷酸化形式（RNA PolⅡS5p）相互作用。

通過ChIP-qPCR糖異生基因附近的14-3-3z和RNA Pol II S5p的結(jié)合信號增加，而敲除14-3-3z后，RNA Pol II S5p富集和糖異生活性顯著降低。這證實14-3-3z結(jié)合并識別H3S28ph，招募RNA Pol II以刺激轉(zhuǎn)錄。    

3.胰高血糖素激活PKA信號通路，PKA隨即被CREB招募到基因組糖異生基因調(diào)控區(qū)域，磷酸化H3S28

先前的研究已經(jīng)建立Gcg-cAMP-PKA級聯(lián)反應。因此，作者繼續(xù)檢驗Gcg-cAMP-PKA級聯(lián)調(diào)節(jié)H3S28ph的假設。在Gcg處理體內(nèi)肝組織和體外原代肝細胞后，均觀察到H3S28ph信號的顯著增加。體外激酶測定表面增加PKA時，H3S28ph也顯著增加。

當作者敲除PKA的催化亞基α時，糖異生活性下調(diào)，而H3.3S28D的表達可以顯著恢復PKA缺失肝細胞中的葡萄糖生成和糖異生基因表達。這證實PKA磷酸化H3S28以響應禁食。

圖4 | 14-3-3z讀取H3S28ph

 

那什么決定了H3S28ph在葡萄糖異生基因上對禁食的特異性呢？作者發(fā)現(xiàn)H3S28ph結(jié)合了豐富的CRE基序，而CREB先前被鑒定為通過與CRE結(jié)合來調(diào)節(jié)糖異生基因轉(zhuǎn)錄的核心轉(zhuǎn)錄因子。在CREB耗盡的肝臟中，由于禁食，H3S28ph顯著降低，PKA和H3之間的相互作用降低，有力地證明了CREB參與PKA的基因組募。

圖5 | PKA磷酸化H3S28并通過H3S28磷酸化調(diào)節(jié)糖異生

 

4.PP2A作為H3S28ph的磷酸酶

先前研究表明PKA和PP2A（絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶）具有相似的識別基序和底物蛋白。為了檢查PP2A是否是H3S28ph的磷酸酶，作者通過體外磷酸酶測定，和CUT&Tag分析證實PP2A抑制H3S28ph磷酸化。進一步地，肝臟PP2A耗竭阻止了H3S28ph對葡萄糖注射的去磷酸化反應，導致體內(nèi)糖異生活性增加和H3S28ph、14-3-3z和RNA Pol II S5p信號在糖異生基因啟動子處的富集顯著增加。這些數(shù)據(jù)共同闡明了PP2A是抑制糖異生基因表達的H3S28ph磷酸酶。

圖6 | CREB指導糖異生基因的H3S28磷酸化

 

研究結(jié)論

饑餓狀態(tài)下，胰高血糖素激活PKA信號通路，PKA隨即被CREB招募到基因組糖異生基因調(diào)控區(qū)域，磷酸化H3S28。14-3-3ζ識別H3S28ph信號并招募RNA聚合酶II激活糖異生基因轉(zhuǎn)錄。

而進食狀態(tài)下，PP2A作為H3S28ph的磷酸酶抑制其磷酸化，繼而抑制糖異生基因的表達。PKA和PP2A通過組蛋白磷酸化/去磷酸化參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達，也可能對其他生物過程產(chǎn)生廣泛的功能影響。

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