單細胞RNA測序技術解析人類胎盤在足月分娩期間的母體-胎兒信號傳導

圖 1

2. 母體和胎兒細胞類型顯示運動驅動的轉錄組活性
接下來，我們探索了CAM和BPPV中由運動驅動的細胞類型特異性轉錄組變化（圖2A）。在CAM中，胎兒Stromal-1、Stromal-2和Stromal-3表現出最大的運動驅動差異基因表達變化（圖2A）。母體蛻膜-1細胞也顯示出相當數量的差異表達基因（DEGs）；然而，與胎兒間質細胞相比，這種變化是溫和的（圖2A）。在BPPV細胞類型中，DEGs數量最多的主要是母體單核細胞類型，其次是胎兒巨噬細胞-2，可能分別對應浸潤性炎癥單核細胞和Hofbauer細胞（圖2A）。分位數-分位數圖顯示了CAM和BPPV中受胎兒和母體影響最大的細胞類型（圖2B），這與表現出最大差異基因表達的細胞類型基本一致。值得注意的是，在CAM中發(fā)現胎兒間質細胞類型受到分娩的影響，母體蛻細胞也是如此（圖2B）。同樣，母體單核細胞和胎兒巨噬細胞-2在BPPV中受分娩影響最大（圖2B）。分娩對細胞類型間基因表達影響的相關性分析表明，母體骨髓細胞、蛻膜細胞和胎兒間質細胞等存在相似之處（圖2C）。胎兒基質亞群中，基質-1表達凋亡信號，基質-2表達ATP代謝，基質-3表達炎癥反應，包括細胞因子的產生（圖2D），表明這些胎兒基質亞群在分娩過程中具有不同的功能。此外，母體decidual -1顯示了與細胞運動和遷移相關的過程的富集（圖2D），這表明decidual細胞參與了分娩過程中的白細胞浸潤。

這些數據為產婦和胎兒細胞類型的分娩特異性轉錄組活性提供了進一步的見解，特別是那些基因表達發(fā)生實質性變化的細胞，如CAM中的結構細胞和BPPV中的免疫細胞。此外，我們證明了在分娩過程中，細胞遷移和增殖、白細胞募集和細胞因子/趨化因子信號通路的細胞類型特異性富集。最具代表性的細胞類型，如滋養(yǎng)細胞，在勞動過程中沒有經歷基因表達的劇烈變化，這表明更多的轉錄活躍亞群，而不是更豐富的亞群，是勞動相關信號的主要貢獻者。
 

圖 2

3. 分娩過程包括由母體-胎兒細胞-細胞串擾協調的炎癥通路
在確定了受分娩影響最大的母胎細胞類型后，我們試圖使用cellchat推斷CAM中母胎串擾的最終變化（圖3）和BPPV（圖4）。我們首先可視化CAM細胞類型的傳入和傳出相互作用，其中每個箭頭的方向和長度分別表示傳入或傳出相互作用的運動驅動優(yōu)勢及其強度，如相應的圖例所示（圖3A）。胎兒間質細胞類型在輸入和輸出的相互作用中都表現出最強的增加（用箭頭的長度表示），暗示這些細胞是CAM中運動相關信號傳導的關鍵參與者（圖3A）。相比之下，母體T細胞、NK細胞和蛻細胞的相互作用減弱（圖3A）。這種相互作用強度分析提供了關于哪些細胞在勞動過程中發(fā)生了輸出和/或輸入信號的變化的信息，但沒有告訴我們這些信號的細胞靶點或來源。因此，我們接下來將每種細胞類型視為信號發(fā)送者或接收者，并評估細胞類型對之間的相互作用強度，如圖熱圖所示（圖3B和圖3C）。胎兒基質細胞類型表現出與分娩相關的強相互作用，以及作為發(fā)送者或接受者的非免疫細胞和免疫細胞（圖3B和C）。此外，多種基質細胞類型表現出自我信號傳導，表明與分娩有關的正反饋循環(huán)（圖3C）。與箭頭圖一致，母體CD4 T細胞的傳入信號隨著分娩而減弱（圖3B）�？紤]到CAM中分娩特異性細胞-細胞信號的實質性變化，我們隨后選擇了受分娩影響的特定信號通路，以推斷出最重要的細胞類型（圖3D-F），這可能表明他們參與了與分娩相關的CAM結構變化。C-X-C基序配體（CXCL）信號通路主要由母體蛻膜-3、巨噬細胞-2和巨噬細胞-1細胞類型驅動，許多相互作用指向胎兒EVT-1亞群以及其他胎兒和母體細胞類型（圖3E），表明母體蛻膜細胞和胎兒滋養(yǎng)細胞之間存在母胎串擾。母體單核細胞和巨噬細胞-1類型驅動TNF信號傳導，可能導致分娩相關炎癥（圖3F）。

在BPPV中，在胎兒基質細胞類型中再次觀察到細胞-細胞相互作用中最強的運動相關變化，基質-1/基質-3主要表現出增加的入射相互作用強度，基質-2/基質-4主要表現出增加的外向相互作用強度（圖4A）。相比之下，胎兒CD4 T細胞、巨噬細胞-2和CTB-3亞群與分娩的相互作用強度下降（圖4A）；這些結果反映在熱圖中，胎兒基質-2亞群顯示出與免疫細胞作為受體的外向相互作用強度增加（圖4B），這主要與炎癥反應有關。

與箭頭圖一致，網絡圖表明胎兒間質細胞類型表現出更強的傳入或傳出相互作用（圖4C）。受分娩影響的top細胞-細胞信號通路包括凝集素、TNF、IL-6、CCL、CD45、II型干擾素（IFN-II）和補體，用網絡圖表示（圖4D-F）。凝集素通路的一個關鍵參與者是母體巨噬細胞-1，它與母體和胎兒單核細胞以及母體T細胞相互作用（圖4D）。相比之下，BPPV中TNF和IL-6信號的主要貢獻者分別是胎兒巨噬細胞-2和基質-3（圖4E和F），進一步表明胎兒對分娩相關的細胞-細胞相互作用有很強的貢獻。綜上所述，這些細胞相互作用分析表明，分娩的特點是母體-胎兒信號通路，涉及免疫和非免疫細胞類型之間的細胞-細胞串擾。
 

圖 3

圖 4

4. 來自胎盤組織的單細胞母體和胎兒特征可以在整個妊娠和分娩期間在母體循環(huán)中被監(jiān)測
接下來，我們評估了細胞類型特異性轉錄組活性是否可以在整個妊娠期間跟蹤母體循環(huán)。我們首先利用先前生成的孕婦外周血（白細胞）的大量轉錄組數據集（n = 49）收集整個妊娠期，并評估細胞類型特異性轉錄物的軌跡（圖5A）。多種細胞類型特征隨胎齡變化而變化；即巨噬細胞-1、巨噬細胞-2、巨噬細胞-3、巨噬細胞-4、CD4 T細胞、CD8 T細胞、B細胞、基質-2、基質-3、基質-4、基質-5、基質-7、蛻膜-1、內皮細胞、LED、npiCTB、EVT-2和STB（圖5B）。觀察到的變化模式在特定細胞類型的單個集群之間不一致；例如，巨噬細胞-1隨著胎齡穩(wěn)步增加，巨噬細胞-2和巨噬細胞-3則隨著胎齡穩(wěn)步增加。巨噬細胞-4呈拋物線軌跡（圖5B），提示每種細胞類型簇的不同作用�？紤]到細胞類型特征可以在母體外周血中追蹤，我們隨后評估了在同一組患者中進行縱向分析的足月分娩婦女（n = 21）和足月分娩婦女（n = 28）足月收集的樣本之間的差異（圖6A）。為了比較這些數據集，使用CAM 衍生的DEG來創(chuàng)建一個偽體數據集，該數據集可以直接與大量轉錄組數據集進行對比，同時仍然考慮每種細胞類型的母源或胎兒來源（圖6A）。CAM與母體外周血細胞類型特異性轉錄本的相關性表明，胎兒基質-2以及母體巨噬細胞-1、巨噬細胞-2、蛻膜細胞-1和單核細胞呈正相關（圖6B）。相比之下，幾種細胞類型特征顯示CAM與母體外周血呈負相關：胎兒EVT-2、母體CD8 T細胞和母體內皮細胞（圖6B）。當使用來自BPPV的細胞類型特征時，我們注意到該組織與母體外周血之間的額外相關性（圖6C）。胎兒EVT-1、CTB-1、巨噬細胞-2、CD4 T細胞、CTB-3、STB和npiCTB在室間都顯示出正相關，母體巨噬細胞-1、巨噬細胞-2、單核細胞和蛻膜細胞-2也是如此（圖6C）。胎兒基質-1以及胎兒和母體NK細胞的特征在BPPV和母體外周血之間呈負相關（圖6C）。這一比較分析支持了胎盤細胞進入母體循環(huán)和/或分娩相關信號驅動外周白細胞轉錄組變化的概念，這些外周白細胞的轉錄組變化至少部分與胎盤組織中的轉錄組變化相同。我們的數據進一步表明，可以無創(chuàng)地跟蹤母胎信號，以監(jiān)測正常妊娠和分娩，并可能用于生成產科疾病的生物標志物。
 

圖 5

圖 6

6. 足月分娩相關的母胎單細胞特征在CAM中部分與自然早產婦女的特征重疊
我們的研究結果表明，隨著分娩，CAM的轉錄組活性似乎經歷了更劇烈的細胞類型特異性變化（圖2A），這與這些組織參與分娩的共同途徑是一致的。雖然被認為是一種不同于足月分娩的病理過程，但自發(fā)性早產也包括激活常見的分娩途徑。因此，我們下一步評估是否在自發(fā)性早產和分娩的婦女組織中也觀察到與產程相關的CAM基因表達變化（產程與PTL）。為此，我們利用了以前CAM的大量轉錄組數據集。來自經羊膜穿刺術診斷羊膜腔炎癥和微生物狀態(tài)不同的早產和自發(fā)性早產婦女：無羊膜內炎癥[低濃度IL-6 (<2.6 ng/mL)，通過培養(yǎng)和分子微生物方法檢測不到微生物](PTL, n = 12)；無菌羊膜內炎癥[IL-6濃度升高（≥2.6 ng/mL），未檢出微生物](PTL+SIAI, n = 17)；或羊膜內感染（IL-6濃度升高，可檢測微生物）（PTL+IAI, n = 11）（85-92）（圖7A）。為了獲得細胞類型特異性PTL相關的變化，將各組CAM的大量轉錄組譜與對照組[經歷過自發(fā)性早產但足月分娩的婦女（n = 15）]進行比較（圖7A）。在CAM中，產期相關特征與胎兒Stromal-1、Stromal-3、Stromal-5、Stromal-7、EVT-1和CTB/EVT的PTL特征呈正相關（圖7B）。母體蛻細胞類型和巨噬細胞對應的特征在產程和PTL之間也觀察到適度的正相關。足月產程與PTL+SIAI呈正相關；即EVT-1、CTB/EVT和基質細胞類型，而其余的僅顯示輕微或最小的正相關（圖7B）。因此，我們的研究結果表明，在足月分娩的生理過程中，CAM中的母胎信號與自發(fā)性早產時觀察到的信號重疊；然而，羊膜腔的炎癥和微生物狀態(tài)驅動母胎細胞類型的特異性轉錄組活性。
 

圖 7

7. 分娩相關的單細胞CAM衍生的特征可以作為非侵入性生物標志物來識別要經歷自發(fā)性早產的婦女
我們最后試圖確定在最終發(fā)生早產的婦女的外周血中，是否可以在妊娠中期和晚期追蹤分娩特異性CAM衍生的scRNA-seq特征，這可能會為即將發(fā)生的早產產生預測性生物標志物。首先，我們使用了之前從橫斷面研究中生成的大量轉錄組數據集，包括來自以下人群的外周血樣本：1)經歷過自發(fā)性早產和早產的婦女（病例）；2)足月分娩的胎齡匹配的對照組。大量轉錄組的主成分分析顯示，病例（紅點）與對照組（藍點）有一定程度的分離，這似乎是由PC2驅動的。然后，我們將分娩特異性CAM衍生的scRNA-seq特征與母體血液轉錄組疊加，并評估每種細胞類型對PC1和PC2的貢獻和相關性。所有細胞類型均參與PC1；單核細胞、LED和基質細胞類型與PC2呈正相關，而NK細胞、CD8 T細胞和巨噬細胞-3與PC2呈負相關。通過建立個體單細胞特征的受試者工作特征（ROC）曲線，我們發(fā)現其中一些（如母體蛻膜-2）對于識別最終發(fā)生早產的早產婦女具有價值。

接下來，我們試圖利用我們的分娩特異性CAM衍生的scRNA-seq特征在妊娠中期和晚期（在早產發(fā)作的臨床表現之前）收集的母親血液樣本中預測兩種不同的自發(fā)性早產亞群（自發(fā)性胎膜完整早產（sPTL）和早產胎膜破裂（PPROM））。我們利用了先前從一項前瞻性大量轉錄組學研究中生成的數據集，包括兩個外部驗證隊列，這些數據來自妊娠17至33周最終接受sPTL或PPROM的婦女的外周血（圖8A）。通過比較從最終經歷早產的婦女和胎齡匹配的足月分娩的對照者收集的血液樣本之間的基因表達譜，獲得了sPTL和PPROM相關的轉錄組活性。這種與sPTL和PPROM相關的轉錄組活性隨后與本研究中產生的運動特異性CAM衍生的scRNA-seq特征相關（圖8A）。在最終接受sPTL或PPROM的婦女的血液循環(huán)中，強烈檢測到幾種分娩特異性CAM衍生的scRNA-seq特征（圖8B）。母體和胎兒來源的多個分娩特異性CAM衍生的scRNA-seq特征-最突出的是母體蛻膜細胞-1和胎兒基質細胞類型-與PPROM相關的轉錄組活性顯示出很強的正相關（>0.10相關系數），相關強度根據采樣時間點而變化（圖8B）。母體巨噬細胞類型與胎兒其他非免疫細胞類型也觀察到中度正相關（>0.05）（圖8B）。足月分娩和sPTL相關轉錄組活性之間的相關性強度低于PPROM；然而，母體蛻膜細胞-1和胎兒基質細胞類型也是主要的貢獻者（圖8B）。來自母體巨噬細胞-2和胎兒EVT-1的實驗室特異性CAM衍生的scRNA-seq特征與PPROM和sPTL相關的轉錄組活性呈負相關。

然后，我們?yōu)槊總�驗證隊列生成ROC曲線，并根據采樣時的胎齡來確定這些特征對sPTL或PPROM的預測程度。對于即將發(fā)生的sPTL的預測，與隊列2相比，使用隊列1的樣本時，母體Decidual-1特征顯示出更大的價值，與這些患者是否在17 - 23歲時采樣無關[隊列1:AUC為0.648 (0.503-0.794)vs隊列2:AUC 0.536（0.389-0.683）或27 - 33[隊列1:AUC 0.602 (0.454-0.750) vs；隊列2:AUC 0.497(0.321-0.674)]妊娠周（圖8C）。相比之下，對于PPROM，隊列2在妊娠17 - 23周[隊列2:AUC 0.612 (0.493-0.731) vs隊列1:AUC 0.564(0.429-0.699)]和27 - 33周[隊列2:AUC 0.654 (0.533-0.775) vs隊列1:AUC 0.610(0.476-0.745)]時的母體Decidual-1特征的預測值略有提高（圖8C）。隊列之間表現的差異可能是由于納入的人群不同（隊列1來自美國密歇根州的底特律，隊列2來自加拿大阿爾伯塔省的卡爾加里）。母體decual -1特征對PPROM的預測價值在孕晚期略有增加[隊列1,27 - 33周：AUC 0.610 (0.476-0.745) vs隊列1,17 - 23周：AUC 0.564 (0.429-0.699)；隊列2,27 - 33周：AUC 0.654 (0.533-0.775) vs隊列2,17 Ga- 23周：AUC 0.612(0.493-0.731)]，表明采樣和結果預測之間的時間縮短。胎兒基質-1信號對sPTL的預測比對PPROM的預測更明顯；然而，與27 - 33周的sPTL相比，其預測性能在17 - 23周有所改善[隊列1,17 - 23周：AUC 0.623 (0.483-0.764) vs隊列1,27 - 33周：AUC 0.559 (0.416-0.703)；隊列2,17 - 23周：AUC 0.559 (0.408-0.710) vs隊列2,27 - 33周：AUC 0.518(0.324-0.711)（圖8D）。對于PPROM，隊列2的胎兒基質-1特征的預測性能在兩個采樣時間都得到了改善[隊列2,17 - 23周：AUC 0.665（0.561-0.769）與隊列1,17 - 23周：AUC 0.579 (0.445-0.712)；隊列2,27 - 33周：AUC 0.633 (0.518-0.748) vs隊列1,27 - 33周：AUC 0.618(0.489-0.747)（圖8D）。這一概念驗證分析表明，在母體循環(huán)中追蹤相關的單細胞特征可能提供一種預測即將發(fā)生的sPTL或PPROM的方法。
 

圖 8

結論
在這里，我們應用scRNA-seq技術發(fā)現，基底膜、胎盤絨毛和絨毛膜羊膜包括母體和胎兒起源的免疫和非免疫細胞類型，但細胞組成不同。先前對胎盤組織的單細胞調查提供了妊娠早期、妊娠中期和妊娠晚期的細胞組成概述，并允許鑒定先前未描述的細胞類型。我們的數據進一步強調了胎盤和胎盤外（絨毛膜和羊膜）組織之間的細胞類型組成和相對豐度的差異，這是由它們不同的功能驅動的。事實上，對妊娠中期絨毛（胎盤）絨毛膜和平滑（胎盤外）絨毛膜的比較分析表明，特定細胞類型（如基質細胞）的豐度不同，以及相似細胞簇之間空間依賴性功能差異。

在懷孕不同時期的單細胞探索清楚地表明，這些隔室的細胞組成不是靜態(tài)的，而是在整個懷孕期間經歷動態(tài)變化。在這里，我們發(fā)現，與胎盤組織相比，絨毛膜羊膜顯示出更多受分娩高度調節(jié)的細胞類型，這與膜激活作為分娩共同途徑的重要組成部分的參與是一致的。絨毛膜羊膜中受分娩影響最顯著的細胞群是胎兒間質細胞、母體蛻膜細胞和母體巨噬細胞。研究了蛻細胞和母體巨噬細胞在分娩過程中的參與；然而，胎兒間質細胞在分娩中的作用尚未得到很好的證實。數據而本項目表明胎兒間質細胞在分娩過程中具有高度活躍的作用，值得進一步研究。此外，我們報道了胎盤組織中受分娩影響最大的細胞類型是胎兒巨噬細胞和母體單核細胞。目前的證據表明，這些細胞主要表現為m2樣表型，與母體細胞相似，這暗示了它們在正常妊娠中的穩(wěn)態(tài)作用。分娩過程中胎兒巨噬細胞參與炎癥信號通路可能表明，這些細胞在分娩過程中經歷了向促炎表型的轉變，這是正常分娩過程的一部分，正如母體蛻膜中存在的巨噬細胞所證明的那樣。胎盤組織中檢測到的母體單核細胞群可能代表存在于絨毛間隙的循環(huán)細胞。

胎盤組織脫落細胞外囊泡、顆粒和其他碎片進入母體循環(huán)。由于這種脫落，母體循環(huán)已被證明是具有診斷潛力的無細胞DNA和RNA的來源，并且母體外周血中的標記物可用于監(jiān)測妊娠和分娩。在這里，我們利用這一概念來監(jiān)測和潛在的預測病理性分娩（如早產）。在沒有羊膜內炎癥的情況下，足月分娩和早產之間的正相關性涉及廣泛的細胞類型。沒有羊膜內炎癥的早產通常被認為是特發(fā)性的，因此這個研究組可能包括多種潛在的機制。事實上，我們之前的工作已經暗示巨噬細胞激活是特發(fā)性早產和出生的潛在免疫機制。相比之下，早產合并羊膜內炎癥的病例似乎涉及相似的細胞類型，無論無菌或微生物性質�；�質細胞和巨噬細胞都是已知的宿主對病原體反應的參與者。母體巨噬細胞的正相關性可能反映了急性組織學絨毛膜羊膜炎的存在，這是一種胎盤病變，是由于微生物侵入羊膜腔時，先天免疫細胞浸潤到絨毛膜羊膜引起的。這些結果表明，生理性分娩婦女的CAM轉錄組學變化與自然早產婦女的CAM轉錄組學變化重疊；然而,如前所述，羊膜腔的炎癥和微生物狀態(tài)也會驅動胎盤轉錄組活性。

本文包括的自發(fā)性早產的兩個亞群，sPTL和PPROM，涉及不同的疾病機制和臨床管理，因此它們的預測和預防需要單獨的研究。事實上，我們注意到sPTL和PPROM之間明顯的失調模式，至少部分取決于采樣窗口。具體來說，最終接受PPROM的女性與接受sPTL的女性相比，表現出更強的運動特異性細胞類型特征正相關。盡管如此，我們發(fā)現這兩個亞群共享基質和蛻膜特征，進一步證實了導致早產的共同分娩途徑。在妊娠中期，最終發(fā)生自發(fā)性早產的婦女表現出特定特征的失調，主要是母體蛻膜細胞，這與蛻膜時鐘的概念一致。此外，我們的研究結果強調了兩個關鍵事實：首先，sPTL和PPROM的潛在機制涉及不同細胞類型特征的改變，這可能使它們能夠使用預測模型進行區(qū)分；其次，在未來的研究中考慮sPTL和PPROM之間的差異是很重要的，因為這些亞群的組合可能會降低檢測特定生物標志物的能力。重要的是，這些結果表明用于預測建模的最佳單細胞特征可能在sPTL和PPROM之間有所不同，進一步支持早產綜合征的多病因性質。

總之，本文的研究結果為足月分娩期間母胎信號和串擾提供了新的見解。我們的研究結果強調了單細胞技術在揭示人類胎盤分娩過程中涉及的新細胞類型和信號通路方面的實用性，并表明胎盤來源的單細胞特征在開發(fā)非侵入性生物標志物方面的潛在應用。

參考文獻：
Garcia-Flores V, Romero R, Tarca AL, Peyvandipour A, Xu Y, Galaz J, Miller D, Chaiworapongsa T, Chaemsaithong P, Berry SM, Awonuga AO, Bryant DR, Pique-Regi R, Gomez-Lopez N. Deciphering maternal-fetal cross-talk in the human placenta during parturition using single-cell RNA sequencing. Sci Transl Med. 2024 Jan 10;16(729):eadh8335. doi: 10.1126/scitranslmed.adh8335. Epub 2024 Jan 10. PMID: 38198568; PMCID: PMC11238316.