雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法步驟詳解

雜交瘤細(xì)胞（hybridoma）是一種在制備單克隆抗體過(guò)程中，用骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞融合而成的細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞一般通過(guò)瘤細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)制備。雜交瘤技術(shù)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。他可使兩個(gè)不同來(lái)源的細(xì)胞核在同一細(xì)胞中表達(dá)功能。
 
雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法：
 
1） 瘤細(xì)胞培養(yǎng)（無(wú)特殊要求）
 
2）免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備
 
3）飼細(xì)胞的制備：常用小鼠胸腺細(xì)胞或小鼠的腹腔細(xì)胞
 
4）細(xì)胞融合
 
融合方法一：
1．將 1ml 40%的 PEG 液一滴滴加入到細(xì)胞團(tuán)中，在 60 秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動(dòng)離 心管或用手指輕彈離心管。
2．在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加 1ml 無(wú)血清培養(yǎng)液，60 秒鐘內(nèi)加完。
3．于 5 分鐘內(nèi)慢慢加完 20ml 無(wú)血清培養(yǎng)基。此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感。
4．離心（800 轉(zhuǎn)/分，8 分鐘） ，去上清，用完全培養(yǎng)液 10ml 懸浮，輕輕混勻。
5．取 96 孔板，每孔加 50 微升。
6．取等體積細(xì)胞懸液，向另一 96 孔板中加 50 微升。
7．送入 5%CO2 溫箱中 37℃培養(yǎng)，24 小時(shí)后更換成 HAT 選擇性培養(yǎng)液。
 
融合方法二：
1．加 0.2ml 43%的 PEG 于離心管中。
2．用預(yù)先消毒的細(xì)玻璃針伸入管中輕輕攪動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。
3．室溫中置 2 分鐘。
4．加入 10ml 完全培養(yǎng)液。
5．800 轉(zhuǎn)/分離心 5 分鐘。
6． 2 倍 HAT 培養(yǎng)液培養(yǎng)懸浮細(xì)胞， 24 孔板， 用 取 每孔中加 0.5ml， 96 孔板每孔中加 0.1ml。 另 7．5%CO2 溫箱，37℃，一周后第一次更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)板中預(yù)先接種有飼養(yǎng)細(xì)胞，加 2× HAT 選擇培養(yǎng)液與原等量培養(yǎng)液混合后，即成為 1×的 HAT 培養(yǎng)基。
 
5）融合后細(xì)胞培養(yǎng)
 
6）抗體的檢測(cè)
 
常用方法：免疫熒光試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)（RIA） ，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。
 
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