免疫細(xì)胞包括很多細(xì)胞:
先天免疫細(xì)胞:粒細(xì)胞(嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞),肥大細(xì)胞,單核細(xì)胞(發(fā)展成巨噬細(xì)胞),中性粒細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞(DC是一種重要的抗原呈遞細(xì)胞(APC),也可以由單核細(xì)胞發(fā)育而來),自然殺傷細(xì)胞(NK具有先天免疫和適應(yīng)性免疫的雙重特性,可以保留為記憶細(xì)胞)。
適應(yīng)性免疫細(xì)胞:B細(xì)胞(有兩個主要功能: ① 向T細(xì)胞提供抗原,② 產(chǎn)生抗體來中和感染性微生物。)T細(xì)胞(有多種作用,并按亞群分類。T細(xì)胞分為兩大類: CD8+ T細(xì)胞或CD4+ T細(xì)胞)。
免疫細(xì)胞的收集免疫細(xì)胞的收集通常說的是外周血單個核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)的收集。正如名字所指出的,PBMC是指外周血中具有單個核的細(xì)胞,包括淋巴細(xì)胞(Lymphocytes)、單核細(xì)胞(Monocytes)、樹突狀細(xì)胞(DC)和其他少量細(xì)胞。
淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞,占據(jù)PBMC細(xì)胞的大多數(shù),也并沒有發(fā)現(xiàn)很多將兩者分開的文章和操作手冊,因此在此我們只針對PBMC細(xì)胞的收集做一個概述。
PBMC存在于外周血中,可利用細(xì)胞分離技術(shù)從全血中分離出來?偟膩碚f,PBMC只占全血樣本的一小部分(約1%),當(dāng)被其他物質(zhì)擠在一起時,很難進行研究。三種最常見的PBMC分離方法包括:密度梯度離心、熒光活化細(xì)胞分選(FACS)、磁激活細(xì)胞分選(MACS),每一種血液分離方法都有自己的優(yōu)點和缺點。
密度梯度離心密度梯度離心依靠物理特性,如大小和密度來分選細(xì)胞群。通過將樣品放入高速旋轉(zhuǎn)的離心機中,不同類型的細(xì)胞將通過與相似密度的顆粒分組來進行分類。密度較大的粒子會落到底部或外面,而密度較小的粒子會停留在中心或上升到頂部。對一個標(biāo)準(zhǔn)的全血樣本進行離心,將分離出血液成分的一般層,集中在試管底部的紅細(xì)胞(大約占總體積的45%),中間層的灰白色涂層層——包含各種白細(xì)胞和血小板(大約占總體積的1%),以及血漿——包含允許血液流動的水狀液體,隨著各種蛋白質(zhì)和溶解的營養(yǎng)物質(zhì)和氣體(大約占總體積的55%)在管的頂部。
根據(jù)所用采血管含有的成分,密度梯度離心也有三種方法。
檸檬酸鈉CPT管采血的細(xì)胞分離
檸檬酸鈉是一種抗凝劑:檸檬酸根可與血液中的鈣離子結(jié)合,生成可溶解性的絡(luò)合物。由于鈣離子在凝血過程中起到促進凝血作用,因此血液中的鈣離子濃度下降會阻止血液的凝結(jié)。
步驟:
1. 室溫(15℃~ 30℃)豎直存放血漿收集管,直到離心。
2. 離心前將試管輕輕倒轉(zhuǎn)8 - 10次,使細(xì)胞重新混合。
3. 將離心管置于水平轉(zhuǎn)子中,室溫(15℃~30℃),1800 x g (RCF)離心30分鐘。轉(zhuǎn)速必須仔細(xì)計算。降速過程中不要使用剎車。應(yīng)注意確保CPT管是正確地安裝在離心機中。
4. 在離心機完全停止后,小心地取出試管并放置在一個架子上。
5. 單個核細(xì)胞和血小板位于血漿層下方的白色層中(見圖1)。
6. 在不干擾細(xì)胞層的情況下,從每根CPT管中抽取血漿層。如果方案要求收集血漿,請參閱方案的具體文件。
7. 用移液管從每個試管中收集單個核細(xì)胞層,并將其轉(zhuǎn)移到50mL帶帽的塑料錐形離心管。
8. 如果收集3根或更少(≤3根)CPT管,將全部CPT管收集到的細(xì)胞層放入一個50mL離心管。
9. 如果收集的CPT管多于3根(>3),則取其中2 - 3根CPT管的細(xì)胞層放入一個50mL離心管。不要將三個以上CPT管的細(xì)胞層組合在一起放入一個50mL離心管。重復(fù)此步驟,直到將所有CPT管的細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到50mL離心管中,然后進行洗滌步驟。
圖1 CPT管離心結(jié)果
帶有預(yù)填充 Frit 屏障的ACD、NaHep或EDTA管采集血液的細(xì)胞分離
在加入血液之前,目視檢查CSTFB,看是否有液體在 Frit上面。如果 Frit上面有液體,將CSTFB在1000 x g下離心30秒。如果有密度梯度離心后溶液仍在 Frit上方,應(yīng)吸除。
步驟:
1. 血液稀釋用于CSTFB分離
血液與生理鹽水的最大比例約為2:1。每10 ~ 20mL全血使用一個50mL管(或每5 ~ 10mL全血用一個12 ~ 14mL管)。按要求使用盡可能多的CSTFB來分配每個樣品的所有血液。
(1) 在每個CSTFB上標(biāo)上樣品識別號。
(2) 用無菌吸管向每個CSTFB中加入生理鹽水溶液:50mL CSTFB管加5mL生理鹽水。
(3) 輕輕混合全血,然后用無菌移液器將血液轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的CSTFB中。
(4) 使用無菌移液器,用生理鹽水沖洗每個原始抗凝血管并轉(zhuǎn)移溶液沖洗量到CSTFB,確保不超過總管體積(生理鹽水+全血)的限制:50mL管的總體積不應(yīng)超過30mL。
(5) 小心蓋上CSTFB。
2. CSTFB密度離心和PBMC收集
(1) 保持試管直立,輕輕轉(zhuǎn)移到離心機上。
(2) 800 ~ 1000 x g, 15℃~ 30℃離心15分鐘,關(guān)閉剎車。(一些樣品在1000g離心PBMC分離的效果可以改善。如果降速過程中存在剎車,就會破壞分層。)
(3) 離心時,準(zhǔn)備新無菌離心管;這將與上一步中使用的管子數(shù)量相同。用樣品識別號標(biāo)記每個試管。
(4) 輕輕將CSTFB從離心機中取出,以免擾亂各層。
(5) 離心使試管(包括 Frit層)的內(nèi)容物分成六個不同的層。
(6) 檢查管里是否有以下可能的問題。根據(jù)實驗室要求記錄觀察結(jié)果和采取的后續(xù)行動。
①、血漿+生理鹽水溶液層。
②、離心后在 Frit上可見凝塊。
③、由于離心速度,時間或制動錯誤,PBMC層較差。PBMC層小而模糊,血漿+生理鹽水層可能略有混濁。
④、由于紅細(xì)胞計數(shù)或紅細(xì)胞比容低,在 Frit上形成PBMC層。
(7) 每個樣品使用新的無菌移液管去除上層淡黃色血漿+鹽水溶液的組分,至云狀白色PBMC帶(位于血漿+鹽溶液層界面和透明分離介質(zhì)溶液間)的上方約1~2厘米的位置。根據(jù)實驗室政策,丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。(或者,上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色PBMC帶可通過上層小心插入移液器移至PBMC帶。)
(8) 使用無菌血清學(xué)移液器收集上述PBMC帶處的所有細(xì)胞。注意不要吸入多于必要的分離介質(zhì)溶液。
(9) 將收集到的細(xì)胞從一個CSTFB轉(zhuǎn)移到一個相應(yīng)的、預(yù)標(biāo)記的無菌離心管。管子可以預(yù)先添加鹽水溶液以節(jié)省時間(50mL管加25mL生理鹽水溶液)。之后進行洗滌步驟。
(10) 將含有剩余的紅細(xì)胞和分離介質(zhì)CSTFB重新蓋上蓋子。按照實驗室政策,將CSTFB作為生物危害廢物丟棄。
圖2 pre-filled Frit Barrier管離心結(jié)果
手動密度梯度介質(zhì)覆蓋或襯底分離細(xì)胞 (Ficoll分離)
分離單核細(xì)胞常使用Ficoll作為分離液的主要成分,F(xiàn)icoll是蔗糖的多聚體,呈中性,平均分子量為400000,當(dāng)密度為1.2g/ml時也未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。
通過Ficoll密度梯度離心,紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大于分離液比重,離心后沉于管底;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液,離心后漂浮于分離液的液面上,也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面上的細(xì)胞,就可從外周血中分離到單核細(xì)胞,并進行之后的培養(yǎng)與檢測。
步驟:
1. 血液稀釋
(1) 打開抗凝血管的蓋子。
(2) 在每根離心管上標(biāo)上樣品識別號(50mL管加12 ~ 22mL血,15mL管加4至5mL血)。
(3) 將血液移入無菌、有標(biāo)記的15或50mL離心管中,根據(jù)制備密度梯度的試劑盒說明加入足夠的生理鹽水來稀釋血液(血液與稀釋液的最大比例應(yīng)為2:1)。
2. 密度梯度細(xì)胞分離
(兩種方法:(1)覆蓋overlay,先制備梯度在加樣品;(2)襯底underlay,先加樣品再加梯度。加完后蓋好蓋子。)
3. 淋巴細(xì)胞密度離心和PBMC收集
(1) 保持試管直立,輕輕地轉(zhuǎn)移到離心機。
(2) 按照說明書概述,在15~30°C條件下,400 x g離心30分鐘,關(guān)閉制動器。(如果降速過程中存在制動會破壞分離層。離心機制動器必須關(guān)閉以使分離干凈,并最大限度地回收pbmc。)
(3) 離心使管內(nèi)內(nèi)容物分成四層。
圖3 ficoll密度梯度離心結(jié)果
(4) 在離心管進行離心時,準(zhǔn)備新的無菌離心管。這將與上一步驟中使用的管子數(shù)量相同。用樣品識別號標(biāo)記每個試管。
(5) 離心完成后從離心機上取下離心管。
(6) 如果看不到細(xì)胞層,確認(rèn)離心機運轉(zhuǎn)正常。糾正你發(fā)現(xiàn)的任何問題。重新離心試管。記錄問題和在研究記錄中采取的行動。
①、如果再離心后細(xì)胞層仍然不可見,記錄,移除和丟棄鹽溶液上清,然后繼續(xù)。
②、如果血漿層非常渾濁,可能很難看到血漿層與密度梯度介質(zhì)的界面。用10mL移液管除去界面上方的大部分血漿可改善淋巴細(xì)胞的收集,例如只留下0.5厘米的血漿層。為了收集細(xì)胞要求更好地定位移液器的尖端。
(7) 每份樣品使用新的無菌移液器,去除上層黃色血漿+生理鹽水溶液的組分,至渾濁白色PBMC帶的上方大約1~2cm的位置(位于血漿+生理鹽水溶液淡黃色組分和密度梯度分離介質(zhì)溶液間)。按實驗室政策丟棄血漿+生理鹽水溶液的組分。(或者,上層血漿+鹽水溶液部分可以保留。而渾濁的白色PBMC帶可通過上層小心插入移液器移至PBMC帶。)
(8) 使用無菌移液管,在PBMC帶(濁白處)收集所有細(xì)胞。注意不要吸入更多的分離介質(zhì)溶液。
(9) 將收集到的細(xì)胞從一個錐形離心管轉(zhuǎn)移到另一個相應(yīng)的、預(yù)標(biāo)記的無菌離心管。離心管可以預(yù)先填充生理鹽水以節(jié)省時間。之后進行洗滌。
4. 重新蓋上裝有剩余紅細(xì)胞/分離物的錐形離心管。按照實驗室政策,將試管作為生物危害廢物進行培養(yǎng)基和丟棄。
流式細(xì)胞術(shù)
涉及到流式細(xì)胞儀的使用的一種免疫細(xì)胞分離技術(shù),流式細(xì)胞儀是一種根據(jù)大小、形狀和熒光亮度等特征標(biāo)記不同顆粒的儀器。這種方法被稱為熒光激活細(xì)胞分選(FACS),它允許樣品流過一個管子,然后將成分分成不同的組。
FACS需要昂貴的設(shè)備和受過適當(dāng)訓(xùn)練的人員。這種技術(shù)在分選需要許多不同群體的不同細(xì)胞樣本時很有用,但使用這種方法分離白細(xì)胞非常耗時。通常,在使用流式細(xì)胞術(shù)處理之前,樣品應(yīng)首先進行“制備”或清理,以分離原始樣品內(nèi)容物的特定子集,這可以減少細(xì)胞分選所需的時間,因為機器將處理更小、更濃縮的樣品量。這樣還可以產(chǎn)生更多健康的、有活力的細(xì)胞,因為當(dāng)處理時間大大減少時,自然細(xì)胞死亡就會減少。
Magnetic-activated cell sorting (MACS) 磁激活細(xì)胞分選
另一種方法是將磁珠與靶細(xì)胞結(jié)合,并使樣品通過磁場,使附著磁鐵的細(xì)胞懸浮。磁激活細(xì)胞分選(MACS)比前面提到的兩種方法更快、更便宜,但它的細(xì)胞損失是三種方法中最高的。強烈的磁場會使細(xì)胞破裂、細(xì)胞器破裂、使樣品混亂。這種細(xì)胞外碎片可引起結(jié)塊和阻塞,從而導(dǎo)致較低的吞吐量。
隨著科技和技術(shù)的不斷進步,相信會有更好的免疫細(xì)胞分離技術(shù)不斷涌現(xiàn),我們也會繼續(xù)關(guān)注相關(guān)發(fā)展,以便為顧客提供更好的服務(wù)。