基礎(chǔ)細胞處理方法及培養(yǎng)步驟詳解

和細胞第一次見面的時候我們要做好什么準備呢？快跟著小M 一起看看吧~

▐  01 記錄細胞重要信息

當?shù)谝淮卧趯嶒炇医邮占毎�系時，有幾條與細胞系有關(guān)的信息應(yīng)該被整理和記錄，這些將確保細胞系的成功繁殖、擴增、冷凍保存和儲存。小 M 強烈建議在細胞擴增開始之前記錄以下信息：(1) 背景信息，(2) 傳代培養(yǎng)，(3) 冷凍保存，(4) 細胞系儲存。

表 1. 需要記錄與細胞系有關(guān)的信息^[1]。

 

注意：細胞培養(yǎng)時，連續(xù)細胞系在培養(yǎng)中會發(fā)生變化。然而，許多研究已經(jīng)證明了長期培養(yǎng)對細胞系形態(tài)、發(fā)育和基因表達的各種影響：如細胞生長變異，導(dǎo)致細胞污染等。因此，當?shù)谝淮螌⒓毎�系接收到實驗室時，留有低傳代的細胞種子庫是非常重要的。▐  02 培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察監(jiān)測和記錄細胞形態(tài)和行為是十分重要的，推薦做法是在傳代培養(yǎng)之前定期仔細地檢查培養(yǎng)細胞，以確定其狀態(tài)和健康狀況。細胞形態(tài)觀察結(jié)果可以幫助“科研汪”們判斷 (1) 細胞的形態(tài)：健康 or 惡化 (即衰老或壞死的細胞)？(2) 是否存在細胞污染？(3) 區(qū)分細胞及細胞密度。大多數(shù)細胞培養(yǎng)生長為：懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。然而，在某些情況下可能會觀察到懸浮和貼壁的混合群體。  

培養(yǎng)中的動物細胞的形狀可分為三個基本形態(tài)：成纖維細胞樣(Fibroblast-like)、上皮細胞樣(Epithelial-like) 和類淋巴母細胞樣(Lymphoblastoid-like)。

圖 1. 培養(yǎng)細胞的一般特征和形狀^[1]。

(A) 上皮樣 (貼壁)；(B) 成纖維細胞樣 (貼壁)；(C) 淋巴母細胞樣 (懸浮液)。

 

(以收到 T25 培養(yǎng)瓶為例)

1. 先觀察培養(yǎng)基顏色以及是否有漏液情況，再在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照，排除細胞本身污染或狀態(tài)不好的情況；

2. 確認細胞狀態(tài)正常后將細胞瓶外壁消毒，放在培養(yǎng)箱靜置數(shù)小時 (根據(jù)細胞密度定) 以穩(wěn)定細胞狀態(tài)；

3.1 貼壁細胞：細胞生長密度超過 80% 時，可根據(jù)情況傳代，若細胞未超過80%匯合度時，可對其培養(yǎng)基進行半換液處理，即吸去一半的原培養(yǎng)基 (不要丟掉可以留給細胞過渡用)，再加入等量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞密度超過 80% 以后再進行傳代；

3.2 懸浮細胞：將細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至離心管，500 g 離心 5 min，溫柔的倒出上清液 (也可以先保留下來以備不時之需)，管底細胞沉淀加入 10 mL 完全培養(yǎng)基吹打、重懸。放入新的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，根據(jù)細胞密度及生長情況分瓶傳代。

圖 2. 臺盼藍染色圖^[2]。

4. 細胞計數(shù)：無血清培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋到 200-2000 個/毫升，在 10-100 µl 的細胞懸液中加入等體積的 0.4% 的臺盼藍溶液。輕輕混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞。活細胞排斥臺盼藍，依舊是透亮的狀態(tài)，死細胞會被染成藍色。有細胞計數(shù)儀的，可直接用計數(shù)儀進行計數(shù)更方便哦~

選擇合適的培養(yǎng)基對于細胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要，不同類型的細胞具有不同的生長需求和特定的培養(yǎng)條件。首先，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)是維持細胞生長和代謝所必需的。不同類型的細胞需要各種不同的氨基酸、糖類、維生素、無機鹽和脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)以滿足其生理需求。如果培養(yǎng)基中缺乏必要的營養(yǎng)物質(zhì)，細胞可能無法正常生長和分裂，甚至?xí)��?dǎo)致細胞死亡[3][4]。選擇合適的培養(yǎng)基的時候優(yōu)先根據(jù)細胞來源公司提供的培養(yǎng)條件，無法確定來源的可以參考 ATCC 推薦細胞對應(yīng)培養(yǎng)基。表 2. 常見細胞的培養(yǎng)體系。

其次，不同類型的細胞需要特定的生長因子和激素來維持其特定的功能和特性。例如，神經(jīng)細胞培養(yǎng)基中通常添加神經(jīng)營養(yǎng)因子 ，以促進神經(jīng)細胞的生長和突觸形成；胎牛血清 通常被添加到培養(yǎng)基中，提供細胞所需的生長因子、蛋白質(zhì)和其他重要組分。

此外，必要時候也可以加入抗生素來防止污染保衛(wèi)細胞。例如雙抗 (青霉素/鏈霉) 甚至三抗 (青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B) 以抑制細菌和真菌等微生物的生長，青霉素-鏈霉素可有效抑制多數(shù)革蘭氏陽性菌 和革蘭氏陰性菌的生長，兩性霉素 B 可用于抑制真菌、酵母的污染。

 

隨著時間的推移，細胞的數(shù)量會增加，而空間和資源卻有限。所以，當細胞達到一定密度時，就該考慮給他們一個更廣闊的居住空間，讓他們繼續(xù)昌盛繁衍。

圖 3. 傳代流程圖。

常見的細胞傳代步驟參考如下：

(以 T25 培養(yǎng)瓶為例)

1. 從培育箱中取出細胞，顯微鏡下觀察細胞，匯合度大于 80% 即可傳代；

2. 準備操作：培養(yǎng)基和 PBS 放置 37℃ 水浴鍋預(yù)熱，將傳代所用耗材(移液管、移液槍、T25 培養(yǎng)瓶、槍頭等) 放入超凈工作臺，紫外滅菌 30 min 后通風(fēng)，將胰酶和預(yù)熱后的培養(yǎng)基以及 PBS 用 75% 酒精消毒后放入超凈工作臺；

3. 吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，5 mL PBS 潤洗細胞，吸棄 PBS；

4. 加入 1 mL 胰蛋白酶，輕晃培養(yǎng)瓶使胰蛋白酶充分覆蓋細胞，放入 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 30 s-2 min (實際孵育時間因所使用的細胞系而異)；

5. 顯微鏡下觀察，當 ≥90% 的細胞脫落時，加入兩倍胰酶體積的含血清的完全培養(yǎng)基，終止消化，吹打細胞層表面數(shù)次，使其分散成單個細胞；

6. 500× g 離心 3-5 分鐘，將細胞沉淀重懸于含血清的完全培養(yǎng)基；

7. 將細胞懸液按傳代比例分裝到培養(yǎng)瓶，補充新鮮完全培養(yǎng)基，輕晃培養(yǎng)瓶使細胞分布均勻，并做好標記；

8. 顯微鏡下觀察細胞密度及狀態(tài)，把細胞送回培養(yǎng)箱。

注意：利用胰蛋白酶進行動物細胞傳代培養(yǎng)時需要考慮許多因素。胰蛋白酶具有水解蛋白質(zhì)的活性，可影響細胞的多種生理代謝功能。

 

Tips：胰蛋白酶傳代培養(yǎng)細胞的最佳方法

• 在添加胰蛋白酶之前，用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的生理鹽水/PBS 清洗，以去除這些離子 (溶液中的 Ca2+、Mg2+ 和血清會降低胰酶活力)；

• 用最低濃度和體積的胰蛋白酶從培養(yǎng)瓶表面去除細胞；

• 如果可能的話，在室溫或更低的溫度下使用胰蛋白酶溶液，以減少酶的內(nèi)吞作用；

• 盡可能短的時間使用胰蛋白酶處理細胞，避免消化過度影響細胞；

• 用胰蛋白酶抑制劑如含血清或血清的完全培養(yǎng)基中和終止胰蛋白酶活性，然后用離心除去胰蛋白酶；

• 細胞脫落后立即離心除去培養(yǎng)瓶表面的胰蛋白酶。

細胞凍存就像是給細胞一個冰凍的時間旅行機票，保證它們在未來可以“解凍”回到活力四溢的狀態(tài)。這一過程可以確保你的珍貴細胞庫不會因為時間的推移而遭受損失。

那么凍存細胞的最佳時機是什么時候？什么樣的細胞濃度合適？要用多少凍存液呢？怎么實現(xiàn)細胞的“慢凍”？復(fù)蘇后第二天發(fā)現(xiàn)細胞沒有活？好不容易復(fù)蘇的細胞竟然污染了？怎么才能讓細胞滿血復(fù)活呢？

關(guān)于這些問題小 M 在往期推文中已經(jīng)為大家整理過了，本期不再贅述。詳情可見往期推文：干貨分享 | 細胞凍存與復(fù)蘇避坑指南 ( 不看后悔 !!!）

今天小 M 和您的細胞之旅就到這里啦，我們下次見~

 

Fetal Bovine Serum (FBS)特級胎牛血清，烏拉圭

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基

DMEM (Low Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES)細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基

RPMI 1640 (L-Glutamine, Phenol Red, no HEPES)細胞培養(yǎng)常用培養(yǎng)基

BM-Cyclin 支原體清除試劑有效抑制和清除在細胞培養(yǎng)中廣泛存在的支原體污染

Penicillin-Streptomycin雙抗，可以對許多細菌引起的污染進行有效的控制

0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red用于細胞解離、常規(guī)細胞培養(yǎng)傳代及原代組織解離，使組織或貼壁細胞分散成單個細胞

[1] Reid YA. Best practices for naming, receiving, and managing cells in culture. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2017 Oct;53(9):761-774.

[2] Aung S M, et al. Live and dead cells counting from microscopic trypan blue staining images using thresholding and morphological operation techniques[J]. International Journal of Electrical and Computer Engineering, 2019, 9(4): 2460.

[3] Jessica Cox, et al. Co-occurrence of Cell Lines, Basal Media and Supplementation in the Biomedical Research Literature. Journal of Data and Information Science. 2020, Vol. 5. Issue (3) : 161-177.

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