細(xì)胞消化酶的種類、特點(diǎn)及選擇依據(jù)

一、細(xì)胞消化酶的重要性

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，消化酶起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞消化酶能夠使細(xì)胞從組織中分離出來(lái)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供純凈的細(xì)胞樣本。消化酶通過(guò)特異性地降解細(xì)胞間的連接物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、膠原蛋白等，使細(xì)胞能夠從組織中脫離出來(lái)，成為單個(gè)細(xì)胞懸液。

例如，胰蛋白酶是目前應(yīng)用最為廣泛的消化酶之一。它對(duì)精氨酸和賴氨酸肽鏈具有選擇性水解作用，可使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣，其活性還與濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)。在 pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。

膠原酶也是常用的細(xì)胞消化酶。膠原酶通過(guò)水解細(xì)胞間質(zhì)的脯氨酸，從而使細(xì)胞離散。它對(duì)膠原的消化作用很強(qiáng)，僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)細(xì)胞損害不大，適于消化分離纖維性組織、上皮和較硬的癌組織。鈣鎂離子和血清不會(huì)對(duì)膠原酶的活性及消化作用產(chǎn)生影響。膠原酶可細(xì)分為不同類型，適用范圍也各不相同。

此外，透明質(zhì)酸酶常與膠原酶等聯(lián)合使用，用于結(jié)締組織的分離；脫氧核糖核酸酶Ⅰ配合膠原酶或透明質(zhì)酸酶等聯(lián)合使用，防止DNA導(dǎo)致的細(xì)胞凝集；中性蛋白酶與膠原酶等聯(lián)合使用，分離纖維樣組織效率高；彈性蛋白酶與胰蛋白酶和膠原酶等聯(lián)合使用，用于分離結(jié)締組織和含有大量細(xì)胞網(wǎng)狀纖維的組織。

綜上所述，細(xì)胞消化酶在細(xì)胞培養(yǎng)中具有不可替代的重要作用，為細(xì)胞生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。

二、常見(jiàn)消化酶種類及特點(diǎn)

（一）胰蛋白酶

胰蛋白酶是一種胰腺絲氨酸蛋白酶，對(duì)堿性氨基酸、精氨酸和賴氨酸的羧基參與的肽鍵具有特異性。它能使天然蛋白、變性蛋白、纖維蛋白和黏蛋白等水解為多肽或氨基酸，主要是動(dòng)物胰臟合成的胰蛋白酶原前體在腸道中受腸激酶活化而產(chǎn)生，商業(yè)用胰蛋白酶多是重組大腸桿菌表達(dá)生產(chǎn)的。胰蛋白酶適用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，但對(duì)纖維組織和硬癌組織效果差。在組織解離的時(shí)候，純化的胰蛋白酶需要與其它酶如膠原酶聯(lián)合使用。

（二）膠原酶

膠原酶主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。目前商用膠原酶是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ 等不同類型，要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。膠原酶對(duì)膠原的消化作用很強(qiáng)，僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)細(xì)胞損害不大，適于消化分離纖維性組織、上皮和較硬的癌組織。鈣鎂離子和血清不會(huì)對(duì)膠原酶的活性及消化作用產(chǎn)生影響。

（三）透明質(zhì)酸酶

透明質(zhì)酸酶是能使透明質(zhì)酸產(chǎn)生水解作用酶的總稱，廣泛分布于自然界中。透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖，在 ECM 中具有限制水分及其它胞外物質(zhì)擴(kuò)散的作用，在各種結(jié)締組織和皮膚中含量豐富。透明質(zhì)酸酶通過(guò)降解透明質(zhì)酸，常與膠原酶聯(lián)合用于結(jié)締組織分離。

（四）脫氧核糖核酸酶

脫氧核糖核酸酶Ⅰ是一種可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。在細(xì)胞分離過(guò)程中，它作用于細(xì)胞分離降解出的 DNA，防止細(xì)胞凝集，一般不單獨(dú)使用，而是配合膠原酶或透明質(zhì)酸酶等聯(lián)合使用。

（五）中性蛋白酶

中性蛋白酶也稱分散酶，來(lái)源于枯草桿菌，具有比較溫和的蛋白水解酶活性，對(duì)細(xì)胞損傷小且可維持細(xì)胞膜完整性。它主要用來(lái)從各種不同組織或器官中消化細(xì)胞外基質(zhì)，釋放并制備原代單細(xì)胞，或用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞收獲和接種轉(zhuǎn)移，也被用于防止懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞意外結(jié)團(tuán)。常與膠原酶聯(lián)合使用。

（六）彈性蛋白酶

彈性蛋白酶是豬胰腺來(lái)源的一種絲氨酸蛋白酶，催化蛋白和多肽水解，尤其是僅次于中性氨基酸殘基的肽鍵，能水解天然彈力素。它常與胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合用于結(jié)締組織分離，例如用于解離包含大量細(xì)胞間纖維網(wǎng)絡(luò)的組織，也用于從肺泡中分離 ATII 細(xì)胞。

三、不同細(xì)胞對(duì)消化酶的選擇依據(jù)

（一）軟組織細(xì)胞

如胚胎、上皮、肝、腎等組織細(xì)胞，常選用胰蛋白酶或與其他酶聯(lián)合使用。這是因?yàn)橐鹊鞍酌高m用于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離這些組織細(xì)胞。例如，在分離胚胎細(xì)胞時(shí)，胰蛋白酶可以作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解，從而使細(xì)胞分散開(kāi)。然而，對(duì)于一些較為特殊的軟組織細(xì)胞，單純使用胰蛋白酶可能效果不佳，此時(shí)可以考慮與其他酶聯(lián)合使用。比如，與膠原酶合用，可以增加對(duì)組織的分離作用。據(jù)研究表明，在分離上皮組織細(xì)胞時(shí)，胰蛋白酶與膠原酶聯(lián)合使用，能夠更有效地分離細(xì)胞，提高細(xì)胞的純度和活性。

（二）纖維性組織和癌組織細(xì)胞

適合膠原酶，因其對(duì)這類細(xì)胞損傷小，能有效分離細(xì)胞。膠原酶對(duì)膠原的消化作用很強(qiáng)，僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用，對(duì)細(xì)胞的損害小，因此適于消化分離纖維性組織和較硬的癌組織。不同類型的膠原酶適用范圍不同，如膠原酶Ⅰ適用于大多數(shù)組織；膠原酶Ⅱ消化能力稍強(qiáng)，通常用于骨、軟骨以及較硬 / 致密的腫瘤等致密組織；膠原酶IV相比于膠原酶Ⅰ消化作用稍微溫和一些。以分離肝臟腫瘤組織細(xì)胞為例，膠原酶Ⅱ能夠有效地消化肝臟中的纖維組織和腫瘤細(xì)胞間質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞與周圍組織分離，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的損傷較小。此外，鈣鎂離子和血清不會(huì)對(duì)膠原酶的活性及消化作用產(chǎn)生影響，這使得膠原酶在處理纖維性組織和癌組織細(xì)胞時(shí)具有很大的優(yōu)勢(shì)。

（三）難消化細(xì)胞

對(duì)于難消化的細(xì)胞，需根據(jù)具體情況選擇含 EDTA 的胰酶或其他組合酶。對(duì)于難消化的細(xì)胞，如 HCT15、LS411 和 KM12 等，用不含 Ca²⁺和Mg²⁺的 PBS 洗滌一次后，加入稍微多一點(diǎn)含 EDTA 的胰酶，置 37ºC 徹底消化（一般為幾分鐘）至脫落，然后再加培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)、離心。這是因?yàn)?EDTA 通過(guò)螯合 Ca²⁺，抑制 Integrin 的貼壁活性，作用更加溫和。對(duì)于一些特別難消化的細(xì)胞，還可以考慮使用胰酶/EDTA 聯(lián)合其他酶的方法。例如，在處理某些纖維性組織中的難消化細(xì)胞時(shí)，可以將胰酶 / EDTA 與膠原酶聯(lián)合使用，增強(qiáng)消化效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于特定的難消化細(xì)胞，采用合適的組合酶進(jìn)行消化，能夠顯著提高細(xì)胞的分離效率，減少消化時(shí)間，降低對(duì)細(xì)胞的損傷。

（四）珍貴細(xì)胞

對(duì)于原代細(xì)胞、干細(xì)胞等異常珍貴，且難培養(yǎng)的細(xì)胞，一般選擇較為溫和的胰酶類似物，消化更溫和細(xì)胞毒性更低，且無(wú)需胰酶抑制劑進(jìn)行中和，更加安全；對(duì)于像iPSC等難培養(yǎng)細(xì)胞，一般選擇Accutase這類復(fù)合酶，更加特異性進(jìn)行消化。

逐典生物供應(yīng)多種細(xì)胞消化酶。對(duì)于常規(guī)工具細(xì)胞，以及 MSC、iPSC 等珍貴細(xì)胞，均有與之相匹配的相應(yīng)消化方案。同時(shí)，針對(duì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，還能提供不同劑型、不同濃度的細(xì)胞消化體系。全方位滿足您的需求，必定能成為您產(chǎn)品研發(fā)之路上的絕佳助力。

逐典生物相關(guān)產(chǎn)品推薦

一．PSCprofTM人多能干細(xì)胞消化液

產(chǎn)品特性
• 溫和高效，傳代存活率高
• 可進(jìn)行單細(xì)胞傳代

二．TryPLUS細(xì)胞消化液

產(chǎn)品特性
• DMF備案
• 非動(dòng)物來(lái)源
• 即開(kāi)即用，方便快捷
• 消化溫和，消化后細(xì)胞活性高
• 無(wú)需胰酶抑制劑，稀釋即可終止