細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)入門(mén)指南

什么是細(xì)胞培養(yǎng)？
    細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動(dòng)物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長(zhǎng)的過(guò)程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過(guò)酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來(lái)源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。
細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟可分為：細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存

• 準(zhǔn)備工作

• 器皿與試劑準(zhǔn)備：清洗、干燥并消毒所有需要的器皿，如培養(yǎng)皿、離心管、移液槍頭等。同時(shí)，配制好培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胰蛋白酶等試劑，并進(jìn)行滅菌處理。
• 無(wú)菌環(huán)境準(zhǔn)備：確保超凈工作臺(tái)或生物安全柜已經(jīng)過(guò)清潔與消毒，紫外線照射足夠時(shí)間以殺滅微生物。
• 預(yù)熱培養(yǎng)液：將配制好的培養(yǎng)基、PBS和胰蛋白酶等放入37℃水浴中預(yù)熱，以減少對(duì)細(xì)胞的溫度沖擊。

• 細(xì)胞復(fù)蘇

• 取出凍存細(xì)胞：從液氮罐中取出凍存管，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)以促進(jìn)快速融化（約1-1.5min）。
• 細(xì)胞懸液制備：將融化的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入適量的培養(yǎng)基稀釋并離心（如1000轉(zhuǎn)/min，5min），以去除凍存液中的DMSO等有害物質(zhì)。
• 接種培養(yǎng)：倒掉上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，放入含5% CO₂的37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

• 細(xì)胞培養(yǎng)

• 換液：根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況定期更換新鮮培養(yǎng)基，通常生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞每2-3天換液一次，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞可3-4天換液一次。換液時(shí)，先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞表面，再加入新培養(yǎng)基。
• 觀察記錄：每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)變化以及培養(yǎng)液的顏色和透明度等，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和傳代時(shí)間等關(guān)鍵信息。

• 細(xì)胞傳代

• 細(xì)胞消化：當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。首先吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞表面，然后加入適量的胰蛋白酶進(jìn)行消化（消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型而定，一般為1-2min）。
• 終止消化：待細(xì)胞變圓并脫落時(shí)，加入等體積的含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化作用。
• 細(xì)胞計(jì)數(shù)與接種：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，倒掉上清液后用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整細(xì)胞密度后接種到新的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

• 細(xì)胞凍存

• 細(xì)胞收集：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。按照傳代步驟收集細(xì)胞懸液并離心去除上清液。
• 配制凍存液：通常使用70%完全培養(yǎng)基+20% FBS（胎牛血清）+10% DMSO的比例配制凍存液。注意DMSO要慢慢滴加并邊滴邊搖勻。
• 細(xì)胞凍存：將細(xì)胞重懸于凍存液中并分裝到滅菌的凍存管中，標(biāo)明細(xì)胞種類、凍存日期等信息。然后按照4℃ 30min、-20℃ 30min、-80℃過(guò)夜的程序進(jìn)行梯度降溫處理，最后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長(zhǎng)期保存。

六、注意事項(xiàng)

• 無(wú)菌操作：整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程以防止微生物污染。
• 操作輕柔：在處理細(xì)胞時(shí)要輕柔操作以減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。
• 監(jiān)控環(huán)境：定期檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、濕度和氣體成分等參數(shù)以確保細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)環(huán)境。
• 及時(shí)記錄：詳細(xì)記錄每一步操作的時(shí)間、條件和結(jié)果以便后續(xù)分析和復(fù)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)。

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