NETRI 3D器官芯片的應用：讓芯片中的細胞互做從2D轉向“類器官”

近年來，類器官（Organoids）和器官芯片（Organ-on-Chip）技術在生物醫(yī)學研究中取得了顯著進展。類器官作為體外三維細胞培養(yǎng)模型，能夠模擬真實器官的結構和功能，廣泛應用于疾病建模、藥物篩選和再生醫(yī)學等領域。然而，類器官在培養(yǎng)過程中仍面臨著微環(huán)境控制不足、重復性差等挑戰(zhàn)。與此同時，器官芯片技術通過模擬器官的微環(huán)境和生理條件，實現(xiàn)更精準的細胞培養(yǎng)和功能研究。將這兩者相結合，能夠有效克服各自的局限性，顯著提升類器官實驗的質量和效率。NETRI團隊在類器官（Organoids）與器官芯片（Organ-on-Chip）技術的結合應用上取得了顯著的進展。他們通過創(chuàng)新的Duplex Well 3D器官芯片，顯著提升了類器官實驗的質量和效率。

傳統(tǒng)的器官芯片通常基于2D培養(yǎng)細胞模型。這種2D系統(tǒng)中，細胞生長在平面的表面上，盡管它們能在某種程度上模擬人體的細胞反應，但它們通常不能提供與實際器官結構和功能相匹配的環(huán)境。隨著技術進步，研究者逐漸認識到，3D細胞培養(yǎng)能夠更真實地模擬細胞在自然環(huán)境中的行為。

3D細胞培養(yǎng)的優(yōu)勢：

• 生理相關性強：3D結構能夠提供更真實的細胞間相互作用和細胞外基質（ECM）環(huán)境，這些是2D培養(yǎng)無法復制的。
• 細胞生長和分化：在3D環(huán)境中，細胞能夠更多地接觸到周圍細胞和基質，促進了細胞的生長、分化和功能表達，尤其對于復雜的多細胞和組織模型尤為重要。
• 模擬復雜的生理狀態(tài)：例如，血液流動、機械力作用以及細胞代謝等復雜因素，都能在3D模型中得到更好的模擬。

Duplex Well 3D器官芯片功能介紹

多孔膜隔離（Porous Membrane）：

• 多孔膜的作用：孔徑為400納米的多孔膜在設備中起到關鍵作用，將上下兩個池隔開。這樣，下方池和上方池之間的物質交換會受到控制（只允許分子物質通過），同時保持一定的物理隔離。對于（eg：腸類器官）和（eg:骨類器官）的共培養(yǎng)，這樣的設計可以幫助模擬復雜的生理條件，如不同環(huán)境的營養(yǎng)物質或信號分子等物質的交換。
• 孔徑：400納米的孔徑適合進行細胞級別的物質交換，同時也可以防止較大物質的跨膜流動，確保實驗的精準性。

上方池和下方池設計（圖中黃色和藍色位置）：

• 上方池的功能：容量為142微升，適合放置不同類型的類器官模型。這個池設計支持二維或三維的細胞結構培養(yǎng)，為類器官的生長提供空間。通過此設計，可以在不同的環(huán)境中培養(yǎng)（eg：腸類器官）或（eg:骨類器官），控制各自的生長條件。
• 下方池的功能：下方池用于營養(yǎng)物質的灌注和細胞因子的轉移。在（eg：腸類器官）和（eg:骨類器官）的共培養(yǎng)中，下方池也可以放置內皮細胞，模擬血管和組織之間的相互作用。

進液口與出液口：

• 進液口：位于左側，用于引入培養(yǎng)介質、藥物或其他成分。
• 出液口：位于右側，用于排出廢物和代謝產物。這個進出水系統(tǒng)使得設備能夠持續(xù)維持實驗條件，并模擬生物體內的物質交換過程。

流體跳線（紅色箭頭裝置）：流體跳線是指在類器官芯片內用于連接不同微流道、實現(xiàn)液體或氣體交換的通道。微流控芯片通常由多個微流道組成，這些微流道通過流體跳線相互連接。它們是芯片內流體動力學的核心，確保細胞、營養(yǎng)物質、藥物和廢物能夠在不同區(qū)域之間順利流動。
 

Duplex Well 3D器官芯片

• 輕量版（8個芯片）
• 完整版（16個芯片）

腦類器官構建
背景和研究重點：
類器官的崛起：在過去的十年里，類器官作為一種非常創(chuàng)新的體外模型出現(xiàn)，并且不僅僅限于大腦，還涵蓋了多個器官。類器官是一種三維、自組織的細胞結構，具有很大的應用潛力，尤其是在藥物發(fā)現(xiàn)、神經毒性篩查等領域。

持續(xù)存在的問題：

• 再現(xiàn)性差：目前類器官的主要問題是缺乏良好的再現(xiàn)性，即不同實驗之間的結果不一致，導致難以復制和驗證實驗結果。
• 技術的工業(yè)化應用困難：將類器官技術從實驗室轉化到工業(yè)規(guī)模也存在很大挑戰(zhàn)。如何在大規(guī)模生產中保持類器官培養(yǎng)的一致性和可重復性是一個關鍵問題。

解決方案：

• 結合特定設備進行培養(yǎng)：為了克服這些問題，研究人員提出了一種解決方案，即將類器官的培養(yǎng)與他們的設備結合使用。這些設備可以提供非常受控的流體流動，保持細胞微環(huán)境的穩(wěn)定，從而提高類器官培養(yǎng)的再現(xiàn)性。
• 工業(yè)兼容性：該方法的一個大優(yōu)點是與大多數(shù)工業(yè)化的檢測和自動化過程兼容，這使得他們的技術更具前景，特別是在將來應用于大規(guī)模生產時。

類器官的應用前景：

• 藥物發(fā)現(xiàn)和神經毒性篩查：類器官，特別是大腦類器官，正在成為藥物發(fā)現(xiàn)和神經毒性篩查中的重要工具。類器官能夠模擬器官的三維結構和功能，為科學家提供更加貼近生理條件的研究平臺。
• 類器官智能化：作者還提到John Hopkinson的研究，他通過結合類器官和人工智能技術，探索類器官在智能化領域的潛力。這種結合使得類器官不僅限于傳統(tǒng)的實驗平臺，還可以進行更為復雜的計算和預測。

使用“duplex well”芯片：

• 芯片設計：研究人員使用一種叫做“duplex well”的高效芯片來解決類器官培養(yǎng)中的問題，并提高其可重復性，同時推動技術的工業(yè)化應用。該設備的設計在功能上對解決類器官培養(yǎng)的缺點非常有幫助。

芯片結構：

• 芯片圖示：左側屏幕上顯示了芯片的示意圖。上面是從上方拍攝的設備圖像，展示了類器官在其中的培養(yǎng)情況。下方是免疫染色后的類器官圖像，便于觀察細胞的形態(tài)和分布。
• 雙層結構：中間的示意圖顯示了類器官和其他細胞的布局。雖然圖中展示了類器官周圍有其他細胞，但此時可以暫時忽略這些細胞，重點關注類器官的培養(yǎng)方式。

類器官的培養(yǎng)方式：

• 開放式和灌流式結構：如Naseeba提到的，芯片的上層是開放式的池，適合3D培養(yǎng)；而底部是灌流式的池，允許培養(yǎng)液流動。這種結構設計非常有利于類器官的生長，因為它既提供了足夠的空間支持三維細胞生長，又通過灌流幫助維持良好的培養(yǎng)環(huán)境。

膜的特性：

• 不粘附膜：類器官與膜之間的接觸較少，類器官不容易粘附在膜上，這對于類器官的培養(yǎng)是非常方便的。這意味著類器官能自由浮動或移動，而不受膜的限制，從而更自然地發(fā)展。

培養(yǎng)液流動的作用：

• 培養(yǎng)液流動：底部的培養(yǎng)液流動幫助維持培養(yǎng)環(huán)境的動態(tài)平衡，避免細胞沉積或培養(yǎng)液的不均勻分布。這種流動有助于提供均勻的營養(yǎng)和氧氣供應，從而促進類器官的健康生長。

優(yōu)化微芯片培養(yǎng)：
研究背景和目標：
1. 實驗目的：

• 研究團隊的首要目標是通過優(yōu)化微芯片上的類器官培養(yǎng)，確保大腦類器官的可重復性。團隊的工作地點是Statexocepiotec實驗室，該實驗室隸屬于CEA，并且Elo目前正在這里進行博士研究。

實驗設計與變量：
1. 實驗條件和變量：
研究團隊通過調整兩大變量來優(yōu)化類器官培養(yǎng)：

• 胚胎體引入時間點：選擇了三個不同的時間點將胚胎體引入設備進行培養(yǎng)，分別是D+2、D+11和D+18。D+2、D+11和D+18代表從胚胎體發(fā)育開始的不同時間點，用來觀察不同時期引入胚胎體對類器官培養(yǎng)的影響。
• 培養(yǎng)液更換方式：研究團隊通過三種不同的方式來更換培養(yǎng)液，這將直接影響細胞的微環(huán)境。具體方式如下：

• 底部培養(yǎng)液每兩天更換一次。
  頂部培養(yǎng)液每兩天更換一次（對于一種條件）。
  頂部培養(yǎng)液每周更換一次（對于另一種條件）。
  頂部培養(yǎng)液完全不更換（作為第三種條件）。

2. 實驗目標：

• 研究的重點在于通過觀察不同培養(yǎng)液更換策略對微環(huán)境的影響，進而確定最佳的培養(yǎng)條件。這些條件的變化將影響類器官的發(fā)育，尤其是對胚胎體及類器官周圍的微環(huán)境的影響。

觀察與結論：
微環(huán)境變化的影響：

• 研究團隊特別強調，通過第三種條件（頂部培養(yǎng)液不更換），營養(yǎng)物質和各種因子只能通過擴散的方式通過膜進入培養(yǎng)環(huán)境。這個策略有助于了解在沒有頻繁更換培養(yǎng)液的情況下，類器官能否維持穩(wěn)定的發(fā)育和生長。
• 微環(huán)境的穩(wěn)定性：通過這種方法，研究團隊可以真實地觀察微環(huán)境穩(wěn)定性對胚胎體和類器官發(fā)育的影響，尤其是長時間不更換培養(yǎng)液是否會影響類器官的發(fā)育。

對照組：

• 為了確保實驗結果的可靠性，研究團隊還使用了傳統(tǒng)的24孔板和96孔板作為對照組，與微芯片上的培養(yǎng)條件進行對比。這種對照實驗有助于驗證微芯片培養(yǎng)條件的有效性和優(yōu)越性。

這部分內容展示了類器官在培養(yǎng)條件、結構重復性和基因表達方面的良好表現(xiàn)，強調了其在藥物篩選和毒理學研究中的潛力。研究團隊通過優(yōu)化培養(yǎng)方法和進一步深入分析，致力于提升類器官模型的可靠性和應用范圍，為未來的生物醫(yī)學研究提供有力支持。

1. 類器官形態(tài)及培養(yǎng)條件的可重復性
形態(tài)觀察：

• 在培養(yǎng)60天后，類器官在所有條件下均成功生長。盡管從圖片上不易觀察，但實際測量數(shù)據(jù)顯示，類器官在大小上的重復性更高。
• 使用duplex well器官芯片培養(yǎng)的類器官呈現(xiàn)出預期的圓形，沒有出現(xiàn)異常形態(tài)。

大小分布：
在duplex well器官芯片中培養(yǎng)類器官，大小的重復性顯著提高。這對于后續(xù)的應用，如神經毒性測試，至關重要。高重復性確保了類器官的表征和預測結果的可靠性，避免因樣本差異導致結論的不準確。

2. 類器官的結構及細胞組成
C2架構：

• 在60天培養(yǎng)后，類器官的視覺結構雖然不易觀察，但在第三種培養(yǎng)條件下（屏幕最右側），不同樣本間的類器官形態(tài)高度相似，優(yōu)于其他條件，尤其是與24孔板對照組相比。
• 類器官中囊腫（cysts）的出現(xiàn)減少，這是有利的，因為過多的囊腫會影響類器官的功能和穩(wěn)定性。
• 類器官中存在具有預期形態(tài)的玫瑰體（rosettes），且類器官邊緣的結構模式組織良好，顯示出良好的初步結構形成。

3. 轉錄水平分析
基因表達：

• 通過RT-QPCR分析了SOX2、CHIP3、BCL2和BACs等基因的表達水平。
• 各培養(yǎng)條件下的基因表達水平與對照組相當，但研究團隊仍需進一步深入研究，以確認表達水平的重復性和穩(wěn)定性。

4. 研究總結與未來方向
研究結論：

• 腦類器官在形態(tài)學上可重復地再現(xiàn)了已發(fā)表的預期結構，具備正確的細胞類型和良好的空間架構。
• RNA表達水平與對照組相當，顯示出類器官在基因表達上的穩(wěn)定性。
• 目前的重點是提高類器官在大小和空間架構上的重復性，并計劃進一步研究細胞類型和基因表達的深入分析。

未來研究方向：

• 研究團隊計劃將胚胎體（embryonic bodies）置入設備中，并優(yōu)化培養(yǎng)基的更新方法。
• 下一步會構建血腦屏障（blood-brain barrier）模型，在屏障兩側培養(yǎng)不同類型的細胞，如側面培養(yǎng)周細胞（pericytes）和星形膠質細胞（astrocytes），底部通道培養(yǎng)腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells）。
• 研究團隊認為，類器官在藥物篩選和毒理評估方面具有巨大潛力，特別是在神經毒性測試和化合物效果篩查方面，類器官的高重復性為可靠的預測結果提供了保障。

5. 應用前景

• 類器官作為細胞培養(yǎng)模型，能夠模擬人體組織的復雜結構和功能，為藥物研發(fā)和疾病研究提供了更為精準和可靠的平臺。
• 通過類器官的高重復性和穩(wěn)定性，可以進行大規(guī)模的藥物篩選，減少實驗誤差，提高研究效率。
• 未來，結合血腦屏障模型，類器官有望在神經科學和腦相關疾病研究中發(fā)揮更重要的作用，提供更接近真實生理條件的研究環(huán)境。