小鼠大腦微觀世界：飛秒雙光子熒光三維顯微成像技術(shù)的前沿研究

隨著科學(xué)研究的不斷深入，對顯微鏡技術(shù)的要求也日益提高。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡雖然廣泛應(yīng)用，但在成像深度和分辨率方面逐漸難以滿足前沿研究的需求。而雙光子熒光（TPF）顯微成像技術(shù)的出現(xiàn)，打開了一扇通往更高分辨率和更深成像深度的大門。這種技術(shù)基于非線性光學(xué)效應(yīng)，具有許多獨特的優(yōu)勢，使其在眾多顯微成像技術(shù)中脫穎而出，成為化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。

河北工業(yè)大學(xué)張澤團(tuán)隊利用飛秒激光器作為激發(fā)光源，搭建了TPF顯微成像系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)測量了TPF光譜，實現(xiàn)了對小鼠大腦切片的激發(fā)，開展了小鼠大腦切片的斷層掃描成像與三維重構(gòu)實驗。在實驗中采用主客觀分析相結(jié)合的研究方法，通過對三維圖像的觀測后再對樣品關(guān)鍵部位的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析，可以快速鎖定研究區(qū)域。在以往的成像研究中常采用直接觀察圖像并結(jié)合光譜的方法對樣品中特定細(xì)胞或組織進(jìn)行定性的分析，卻少有研究通過處理強(qiáng)度分布數(shù)據(jù)來對樣品的關(guān)鍵部位進(jìn)行定量的分析。

成像理論與實驗
一、成像理論基礎(chǔ)
1.雙光子熒光空間分布
通過對高斯光束復(fù)振幅在空間中的分布進(jìn)行分析，推導(dǎo)出TPF信號的縱向與徑向分布公式，揭示了TPF信號強(qiáng)度在空間中的變化規(guī)律，為理解成像系統(tǒng)的分辨率和成像深度提供了理論依據(jù)。

2.成像深度與分辨率
成像深度與激發(fā)光在組織中的散射長度、熒光量子效率、熒光收集效率以及激發(fā)光脈沖的重復(fù)頻率和脈沖寬度等有關(guān)，通過合理調(diào)整這些參數(shù)，可以增加成像深度。而分辨率方面，橫向分辨率與激發(fā)光波長、物鏡數(shù)值孔徑等因素相關(guān)，根據(jù)相關(guān)公式計算出本實驗中成像系統(tǒng)的理論橫向分辨率為453nm，縱向分辨率為2.087μm。

2.小鼠大腦切片的TPF顯微成像實驗操作步驟
首先測量羅丹明B溶液的TPF光譜，選擇合適的探測窗口。在進(jìn)行小鼠大腦切片成像時，將樣品放置于電動平臺，調(diào)整焦距和增益檔位，選擇成像區(qū)域。通過掃描光路對樣品進(jìn)行二維掃描，激發(fā)熒光并采集信號，最后由電腦處理得到顯微成像結(jié)果。在實驗過程中，還對不同激發(fā)功率下的成像結(jié)果進(jìn)行分析，研究熒光強(qiáng)度與激發(fā)功率的關(guān)系。

研究結(jié)論
一、成像系統(tǒng)性能參數(shù)的精確測定
1.成像深度的深度剖析
通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灪蛿?shù)據(jù)分析，確定了成像系統(tǒng)的成像深度。數(shù)值的得出并非偶然，而是在對小鼠大腦切片進(jìn)行細(xì)致的三維重構(gòu)實驗以及對樣品關(guān)鍵部位熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)深入分析的基礎(chǔ)上獲得的。在實驗過程中，我們從樣品表面到14μm深度范圍內(nèi)對小鼠大腦切片沿Z軸進(jìn)行了斷層掃描成像，每采集一次圖像向下移動1μm的距離，如同在微觀世界中逐層揭開大腦的神秘面紗。

通過對不同深度處熒光強(qiáng)度的精確測量和分析，我們發(fā)現(xiàn)隨著深度的增加，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，而在12.9μm深度之后，成像系統(tǒng)采集到的信號主要為噪聲，這表明該深度是成像系統(tǒng)能夠有效獲取有用信息的極限，從而準(zhǔn)確界定了成像深度。這一成像深度的確定為我們在研究小鼠大腦以及其他類似生物樣品時提供了一個重要的參考指標(biāo)，幫助我們了解該成像系統(tǒng)能夠深入探測樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的程度。

2.橫向分辨率的精準(zhǔn)評估
采用了一種巧妙的方法：在小鼠大腦切片樣品中尋找不含組織細(xì)胞的狹窄縫隙，通過分析成像結(jié)果中這些縫隙位置的強(qiáng)度分布曲線，確定能夠分辨的最小距離，從而得出橫向分辨率。盡管實驗中得到的橫向分辨率數(shù)值大于理論計算的453nm，但這一結(jié)果仍然反映了成像系統(tǒng)在實際應(yīng)用中的分辨能力。由于樣品中可能不存在間距剛好為最小分辨率的理想縫隙，所以實際測量值會受到一定限制，但這也為我們進(jìn)一步優(yōu)化實驗方法和提高分辨率提供了方向。

二、小鼠大腦微觀結(jié)構(gòu)成像的重要發(fā)現(xiàn)
1.灰質(zhì)與白質(zhì)分布的清晰呈現(xiàn)
實驗清晰地展示了小鼠大腦中灰質(zhì)與白質(zhì)在不同深度的分布情況。在樣品表面，灰質(zhì)部分相較于白質(zhì)具有更高的熒光強(qiáng)度，這一現(xiàn)象表明灰質(zhì)在該區(qū)域可能具有更為活躍的分子活動或者更高的物質(zhì)密度。隨著深度的增加，灰質(zhì)部分的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，而白質(zhì)部分的熒光強(qiáng)度開始增加，在3μm的深度，白質(zhì)的熒光強(qiáng)度開始高于灰質(zhì)部分，在6μm的深度，灰質(zhì)部分的熒光信號幾乎消失，強(qiáng)度僅為白質(zhì)部分的1/18。

這一系列變化揭示了小鼠大腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和層次性�；屹|(zhì)主要存在于樣品的淺層，這與灰質(zhì)在大腦中承擔(dān)的重要功能密切相關(guān)，如信息處理、認(rèn)知和感知等功能可能主要在淺層灰質(zhì)區(qū)域進(jìn)行。而白質(zhì)部分厚度更大且縱向分布更廣，這與白質(zhì)在大腦中負(fù)責(zé)神經(jīng)信號傳導(dǎo)的功能相契合，其廣泛的分布有助于在大腦不同區(qū)域之間快速傳遞信息。

2.熒光強(qiáng)度變化與大腦功能的潛在關(guān)聯(lián)
灰質(zhì)和白質(zhì)熒光強(qiáng)度隨深度的變化不僅僅是簡單的光學(xué)現(xiàn)象，更可能與大腦的生理功能有著緊密的聯(lián)系�；屹|(zhì)熒光強(qiáng)度在淺層較高可能意味著該區(qū)域神經(jīng)元活動頻繁，需要更多的能量和物質(zhì)交換，從而導(dǎo)致較高的熒光信號。而隨著深度增加熒光強(qiáng)度減弱，可能反映出隨著信號傳遞到大腦更深層次，神經(jīng)元活動方式或物質(zhì)代謝發(fā)生了變化。

白質(zhì)熒光強(qiáng)度在一定深度增加，可能是由于隨著深度增加，神經(jīng)纖維束的結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，影響了熒光物質(zhì)的分布和激發(fā)效率。這些熒光強(qiáng)度的變化為我們理解大腦功能的分區(qū)和神經(jīng)信號傳遞機(jī)制提供了新的線索，有助于進(jìn)一步研究大腦在正常生理狀態(tài)以及疾病狀態(tài)下的功能變化。

展望未來
一、對神經(jīng)科學(xué)研究的深遠(yuǎn)影響
為神經(jīng)科學(xué)研究提供了一個強(qiáng)大的工具和新的視角，有助于我們更深入地理解哺乳動物大腦的微觀結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元作用機(jī)制。通過清晰地呈現(xiàn)小鼠大腦灰質(zhì)和白質(zhì)的分布以及它們在不同深度的熒光強(qiáng)度變化，我們能夠更準(zhǔn)確地構(gòu)建大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的三維模型，進(jìn)一步了解神經(jīng)元之間的連接方式、信息傳遞路徑以及突觸可塑性等關(guān)鍵問題，這對于揭示大腦的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等高級功能的神經(jīng)基礎(chǔ)具有重要意義。

在神經(jīng)疾病研究領(lǐng)域，通過對患病小鼠大腦的成像研究，可以觀察到疾病狀態(tài)下大腦微觀結(jié)構(gòu)的異常變化，如灰質(zhì)萎縮、白質(zhì)病變等情況，從而深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制。例如，在阿爾茨海默病研究中，我們可以利用該技術(shù)追蹤神經(jīng)元之間的連接受損情況，以及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過程中的異常變化，為疾病的早期診斷、藥物研發(fā)和治療效果評估提供重要的實驗依據(jù)。

二、推動成像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展
對成像系統(tǒng)性能參數(shù)的測定以及實驗過程中遇到的問題，為后續(xù)成像技術(shù)的優(yōu)化提供了明確的方向。同時，針對成像深度的進(jìn)一步提升，我們可以研究新型的激光源或光學(xué)元件，優(yōu)化光路設(shè)計，減少光在組織中的散射和吸收，從而增加成像深度。此外，提高成像速度也是一個重要的研究方向，這將有助于在活體生物樣品研究中捕捉更快速的生理過程，如神經(jīng)信號的動態(tài)傳遞等。

未來，TPF顯微成像技術(shù)有望與其他先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行融合，產(chǎn)生更強(qiáng)大的研究工具。例如，與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，我們可以對特定神經(jīng)元群體進(jìn)行標(biāo)記和功能調(diào)控，然后利用TPF顯微成像技術(shù)實時觀察這些神經(jīng)元在生理和病理狀態(tài)下的變化，實現(xiàn)對大腦功能的精準(zhǔn)解析。與光遺傳學(xué)技術(shù)融合，可以在對神經(jīng)元進(jìn)行光學(xué)刺激的同時進(jìn)行高分辨率成像，研究神經(jīng)元活動與行為之間的因果關(guān)系。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：張澤,侯國忠,鄧巖巖,章媛,張德林,李兢兢,王雨雷,呂志偉,夏元欽.小鼠大腦飛秒雙光子熒光三維顯微成像研究[J]. 紅外與激光工程,2023,52(8):20230201.DOI:10.3788/IRLA20230201.