核酸檢測實驗室清除氣溶膠污染的日常操作

核酸檢測實驗室（qPCR）如何清除污染？
 
早在2020年5月1日，國家衛(wèi)健委發(fā)布《關(guān)于落實常態(tài)化疫情防控要求進(jìn)一步加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染防控工作的通知》，從七個方面對進(jìn)一步加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)感染防控工作提出了具體要求。其中一條要求就是對所有三級醫(yī)院以及縣醫(yī)院開展建設(shè)，使其迅速達(dá)到新冠病毒核酸檢測條件；對其他二級以上醫(yī)院也應(yīng)當(dāng)同時加強(qiáng)建設(shè)，使其逐步達(dá)到新冠病毒核酸檢測條件，根據(jù)疫情防控形勢需要隨時能夠開展核酸檢測工作。
6月8日，國家衛(wèi)健委再次發(fā)布《關(guān)于加快推進(jìn)新冠病毒核酸檢測的實施意見》，強(qiáng)調(diào)了擴(kuò)大核酸檢測范圍的重要性，明確了擴(kuò)大檢測范圍的能力要求�！秾嵤┮庖姟诽岢鰪募訌�(qiáng)實驗室建設(shè)、強(qiáng)化質(zhì)量控制和生物安全、加強(qiáng)人員規(guī)范培訓(xùn)、加快設(shè)備產(chǎn)能提升、確保信息安全暢通等5個方面推進(jìn)加快提升檢測能力，全力滿足檢測需求。特別強(qiáng)調(diào)各地要加強(qiáng)三級醫(yī)院、傳染病�？漆t(yī)院、縣（區(qū))級及以上疾控機(jī)構(gòu)、海關(guān)及有條件的縣醫(yī)院實驗室建設(shè)，使其具備開展新冠病毒檢測能力。

然而實際上，三級綜合醫(yī)院不具備核酸檢測能力的少之又少，大多已經(jīng)實現(xiàn)了PCR實驗的基本要求，差別只在于開展項目略有不同，這項要求真正難以落實的主要問題是：二級醫(yī)院/縣醫(yī)院建立PCR實驗室不容易。

PCR實驗，即臨床基因擴(kuò)增實驗，是專門用來做無創(chuàng)產(chǎn)檢、檢驗?zāi)[瘤、艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等基因遺傳和病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。
就新冠病毒核酸檢測來說，RT-PCR是目前使用最廣泛和較準(zhǔn)確的篩選和確認(rèn)方法，大規(guī)模核酸檢測，必然會引起相關(guān)機(jī)構(gòu)單位著力建設(shè)規(guī)范的臨床PCR實驗室。但是，建立一個PCR實驗室，其實就是在建設(shè)一個平臺，考驗的不僅僅是一個醫(yī)療機(jī)構(gòu)的實驗?zāi)芰�，也考驗著整個醫(yī)療機(jī)構(gòu)的整體能力。

下面就為大家整理一下PCR實驗室建設(shè)及日常管理方面的一些問題。
臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室設(shè)計的核心問題是什么？
實驗室的平面布局、空調(diào)通風(fēng) 系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞同一個核心問題進(jìn)行——“避免污染”，任何級別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實驗室時，均需要提前考量各個因素，以保證標(biāo)本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實驗室的生物安全。
建設(shè)要求：
PCR實驗室的建設(shè)需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的“四區(qū)”：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、PCR擴(kuò)增檢測區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測區(qū)。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
人員要求：
進(jìn)入PCR實驗室，需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實驗原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項等規(guī)范的培訓(xùn)，并獲取PCR上崗證。
檢測風(fēng)險：
檢測過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能產(chǎn)生氣溶膠，有感染的風(fēng)險。
防護(hù)要求：必須按照生物安全三級實驗室的個人防護(hù)要求進(jìn)行。
 
PCR實驗的污染來源都有哪些？
樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)導(dǎo)致外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。
實驗試劑污染：主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中，因為PCR試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃，但這個過程也充滿污染風(fēng)險。
擴(kuò)增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是PCR反應(yīng)中最主要、最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
克隆質(zhì)粒污染：作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
 
 
防止實驗污染都有哪些措施？
對于低流行地區(qū)，PCR檢測人員經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)上崗后，核酸污染的風(fēng)險相對較小，但在疫區(qū)超負(fù)荷工作時，就可能會遇到核酸污染的問題，可通過以下措施降低污染機(jī)會：
正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進(jìn)行開蓋操作時容易發(fā)生交叉污染。
正確使用生物安全柜：簡單、整潔、避免通風(fēng)口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑和氣溶膠污染祛除劑隨手可及；廢液缸應(yīng)及時噴灑核酸氣溶膠祛除劑，并且及時清理廢液缸，保證廢物不超過其體積的2/3。
核酸提取儀去污染：每天多批次檢測時，在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸氣溶膠祛除劑對儀器進(jìn)行去污染。
重視通風(fēng)：不定期對房間進(jìn)行通風(fēng)，每次至少持續(xù)30min。
PCR擴(kuò)增區(qū)去污染：PCR反應(yīng)管必須蓋緊，避免擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物對環(huán)境的污染。
注：實驗室應(yīng)配備隨手可及的消毒劑和氣溶膠污染祛除劑。
PCR實驗室的空氣流向管理與環(huán)境消毒？
前文提到，PCR實驗室可分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物檢測區(qū)四個區(qū)域，這四個區(qū)域在物理空間上必須完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。
所以，臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的空氣流向應(yīng)按：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測區(qū)，應(yīng)時刻防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前區(qū)域。可按照上述順序區(qū)域空氣壓力遞減的方式進(jìn)行，也可通過安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行方式實現(xiàn)。
 
臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室的環(huán)境清潔：《臨床基因擴(kuò)增實驗室工作規(guī)范》中有對物表清潔、消毒的要求，不同的實驗區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
基本原則：由清潔區(qū)向污染區(qū)進(jìn)行，潔具不可交叉。
清潔消毒方向：準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測區(qū)
清潔消毒范圍：工作區(qū)域的物體表面(含桌、椅)，可使用核酸氣溶膠祛除劑噴灑，空氣和工作臺面可使用核酸氣溶膠祛除劑噴灑和紫外線照射消毒，也可使用空間消毒器進(jìn)行全環(huán)節(jié)消毒。
注：不可使用紫外線消毒器及化學(xué)消毒進(jìn)行有人狀態(tài)下的消毒。
PCR室內(nèi)的消毒應(yīng)防止揚塵（減少人員走動）、消除DNA或RNA基因片段�？蛇x擇核酸氣溶膠祛除劑和懸掛紫外線燈管進(jìn)行空氣消毒，試驗前后噴灑核酸氣溶膠祛除劑和照射30-60分鐘，實驗結(jié)束照射30-60分鐘，必要時延長照射時間（可照射一夜）。
終末消毒：當(dāng)出現(xiàn)實驗室污染時，應(yīng)按要求立即撤出相關(guān)人員，在無人情況下可使用化學(xué)消毒劑進(jìn)行終末消毒，如熏蒸法：過氧乙酸1g/ m³加熱熏蒸（濕度70-90%），密閉24小時；核酸氣溶膠祛除噴霧：25mL/m³；3%過氧化氫：20mL/m³噴霧；5%過氧乙酸2.5mL/m³噴霧（濕度20-40%）。
日常清潔消毒應(yīng)該如何做？
每日工作前后，對工作區(qū)域表面、地面進(jìn)行清潔并消毒，使用核酸氣溶膠祛除劑噴灑，清潔采用濕式、不揚塵的方式進(jìn)行。
物品防塵存放，墻面定期清潔，有可見污染及時進(jìn)行清潔消毒。
配備移動紫外線消毒裝置進(jìn)行空氣和物表的消毒。
生物安全柜的消毒：
每天工作前：對生物安全柜的內(nèi)表面進(jìn)行消毒，包括工作臺面和內(nèi)壁使用核酸氣溶膠祛除劑噴灑擦拭。
工作結(jié)束：柜內(nèi)物品全部消毒后移出。核酸氣溶膠祛除劑噴灑擦拭臺面四周、以及玻璃內(nèi)側(cè)燈部位。
消毒劑應(yīng)選擇能夠殺死生物安全柜里可能發(fā)生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒劑）。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后，還應(yīng)用無菌水再次進(jìn)行擦拭。
停用生物安全柜前，運行5min以凈化內(nèi)部空氣。
實驗完成后，物品及環(huán)境如何處理？
 
做好廢液及固廢處理；
實驗室空間消毒：在室溫，50-60%濕度條件下，使用過氧乙酸熏蒸2g/m³，過夜；
物體表面消毒液：0.55%含氯消毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時內(nèi)使用。
 
PCR實驗室是否有較為便捷的核酸氣溶膠清除方法呢？
考慮到PCR實驗室屬于氣溶膠污染的高發(fā)區(qū)域，除對其進(jìn)行日常的清潔消毒外，還要考慮核酸氣溶膠污染物對實驗結(jié)果的影響，氣溶膠污染物給實驗人員工作帶來極大困擾，那目前是否有一些較為便利的方法呢？
 
 
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