一次性使用固定床生物反應器與微載體攪拌罐的對比

摘要 
埃博拉病毒病(EVD)是一種致命性疾病，近年來偶發(fā)于非洲大陸，并導致嚴重的疫情。rVSV-ZEBOV是一種重組水泡口炎病毒結構，其中的天然病毒糖蛋白替換為埃博拉病毒(Zaire)糖蛋白。免疫被認為是預防這種高傳染性疾病最有效的方法。所以，迫切需要開發(fā)經濟高效且可放大的疫苗生產工藝，以使疫苗可大規(guī)模使用。貼壁細胞被廣泛用于疫苗的開發(fā)和商品化生產。由于生物工藝行業(yè)近來的發(fā)展，對病毒性疫苗有很大的需求，超過了當前的生產能力。但是，使用傳統(tǒng)技術(如攪拌罐、靜態(tài)細胞培養(yǎng))進行病毒疫苗的生產會有一定的局限性，如有限的可放大性、靈活性以及較高的生產成本。Univercells Technologies開發(fā)了一種可規(guī)模放大的新型固定床生物反應器，可幫助以可負擔的形式，為市場提供所需數量的疫苗產品。在本研究中，將rVSV-ZEBOV的Vero細胞無血清生產工藝從微載體攪拌罐生物反應器轉移到了Univercells Technologies的scale-X™固定床生物反應器。我們證實，固定床生物反應器培養(yǎng)可獲得均勻的細胞分布，以及感染性病毒顆粒更高的細胞特異性產率。此外，將細胞培養(yǎng)工藝從攪拌罐生物反應器成功轉移到固定床生物反應器，可較低設備占地，并實現更具成本效益的生產。
 
1. scale-X™一次性使用固定床生物反應器 2. 工藝設置

細胞系 & 病毒: 貼壁Vero細胞系源于 ATCC CCL-81.5 & 使用病毒為VSV-ZEBOV。
實驗# 1: 比較微載體和固定床中的Vero細胞生長，并評估固定床中的細胞均質性。
 
STR中的微載體培養(yǎng): 生物反應器培養(yǎng)在1L生物反應器內進行(Applikon Biotechnology)。生物反應器中的微載體濃度為2 g/L。使用VP-SFM+ 4mM L-谷氨酰胺培養(yǎng)基，并添加 0.1%泊洛沙姆199。接種密度22,700 cells/cm²，工作體積850 mL。
 
scale-X™ hydro 生物反應器培養(yǎng): 生物反應器培養(yǎng)在2.4m² hydro 生物反應器中進行。使用VP-SFM+ 4mM L-谷氨酰胺培養(yǎng)基。接種液工作體積700mL，密度約為11,458 cells/cm²。循環(huán)使用2L體積，以10mL/min的流速進行。
 
實驗# 2: 評估固定床vs微載體中的VSV-ZEBOV生產。細胞以與微載體生物反應器(22,727 cells/cm² ) 相似的細胞密度接種固定床(22,708 cells/cm² ) ，生物工藝以相同的方式進行，工藝參數維持為相同的設定點。在相同的3天細胞培養(yǎng)時間后，以MOI 0.01，感染rVSV-ZEBOV。
   
3. 結構化固定床中均勻的Vero細胞生長

微載體生物反應器和scale-X™ hydro固定床生物反應器中的Vero細胞生長相當。不同的細胞接種濃度導致了略有偏移但相當的生長趨勢。scale-X™生物反應器中的單位面積細胞濃度(2.7x 10⁵   cells/cm² )稍高于微載體培養(yǎng)(2.4 x10⁵  cells/cm² )(圖4)。主要代謝底物濃度數據顯示，兩種系統(tǒng)中具有相似的生物動力學。  
4. 病毒產量
 
在34°C 時，微載體生物工藝中的細胞密度在感染后不再繼續(xù)增加，但在固定床生物反應器中，感染后的第一個24小時內，細胞密度沒有出現同樣的急劇下降 (圖6 & 7)。感染后24小時，達到最高感染性滴度1.95×10⁷ TCID50/mL，說明，由于相比微載體系統(tǒng)，細胞被更緊實地填充在固定床中，從而可能可使病毒在該空間內更容易地貼附到細胞，所以獲得了更快的反應動力學。此外，在感染后的前4小時，固定床單元和培養(yǎng)基瓶之間的培養(yǎng)液循環(huán)暫停。相比微載體生物反應器，在該段時間內，病毒的單位體積濃度可提高2.8倍。  
此外，相比微載體工藝中生產峰值時1130 VG/TCID50 的病毒基因組和感染性滴度比例，固定床生物反應器中僅為101 VG/TCID50，說明其生產的病毒質量更好，從最高細胞密度看，固定床生物反應器生產峰值時，可獲得 14.4 TCID50/cell和1459 VG/cell的比例。這表示相比微載體系統(tǒng)，固定床生物反應器中感染性顆粒的細胞特異性產率可提高1.9倍。該工藝可進一步優(yōu)化，以證實scale-X™平臺的可放大性。

5. 結論
scale-X™ hydro固定床生物反應器可生產與微載體運行相似的感染性滴度，但達到的生產時間更短。此外，固定床生物反應器生產rVSV-ZEBOV的病毒基因組和感染性滴度比例更低，而感染性病毒顆粒的細胞特異性產率更高。總體結果顯示，當工藝轉移至固定床scale-X™生物反應器時，可獲得相似的細胞生長趨勢和最高單位面積細胞濃度。最后，對Vero細胞生長分布的研究顯示，固定床內有均勻的細胞貼附和生長。相比微載體工藝，固定床的緊湊設計可使設備占地降低5倍。結果同時顯示，結構化scale-X™固定床生物反應器不僅是替代傳統(tǒng)“規(guī)模擴展”技術的合適方式，如多層培養(yǎng)皿和滾甁，也可替代技術上更具挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)系統(tǒng)，如微載體工藝。


原文翻譯：S,Kiesslich, J.P.V.Losa, J.G´ elinas, et al., Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells: microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology, 2020, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2020.01.015.