微升級(jí)單細(xì)胞液滴篩選系統(tǒng)用于微生物高通量自動(dòng)化單克隆培養(yǎng)與分選

清華大學(xué)生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)開發(fā)微升級(jí)單細(xì)胞液滴篩選系統(tǒng)用于微生物高通量自動(dòng)化單克隆培養(yǎng)與分選。

單克隆菌落的分離、培養(yǎng)和挑取是微生物研究的關(guān)鍵操作。1881年，Robert Koch發(fā)明了在固體平板上進(jìn)行微生物純培養(yǎng)的方法，已經(jīng)成為微生物單克隆培養(yǎng)和挑取的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。然而在面對(duì)日益多樣的高通量需求時(shí)，基于固體平板的方法由于通量低、培養(yǎng)基利用率低以及存在大量的人工操作，通常要消耗大量人力物力。雖然近些年也發(fā)展了一些整合菌落挑取儀、移液工作站等儀器與機(jī)械臂的自動(dòng)化工作站，但這種平臺(tái)復(fù)雜而昂貴。近年來液滴微流控技術(shù)的發(fā)展為自動(dòng)化高通量微生物培養(yǎng)和篩選提供了新的解決方案。然而目前大多數(shù)相關(guān)系統(tǒng)使用皮納升液滴，由于其體積小，導(dǎo)致檢測(cè)方面諸如檢測(cè)靈敏度低，高度依賴特定的化學(xué)試劑和探針，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜昂貴等問題。同時(shí)這些系統(tǒng)通常以堆疊的方式培養(yǎng)液滴，較難單獨(dú)和依次收集目標(biāo)液滴，不能完全實(shí)現(xiàn)單克隆菌落的單獨(dú)獲取。

近日，清華大學(xué)化工系生物育種技術(shù)與裝備團(tuán)隊(duì)在生物工程領(lǐng)域國際知名期刊Biotechnology and Bioengineering上發(fā)表了題為“Single‐cell microliter‐droplet screening system (MISS Cell): An integrated platform for automated high‐throughput microbial monoclonal cultivation and picking”的文章，論文通訊作者為張翀副教授。文章報(bào)道了一種自動(dòng)化和集成化的微流控平臺(tái)——微升級(jí)單細(xì)胞液滴篩選系統(tǒng)（MISS Cell），可用于在2.0-2.5 μL的液滴中進(jìn)行自動(dòng)化高通量的微生物單克隆培養(yǎng)和分選，通量可達(dá)104。MISS Cell是一個(gè)高度集成的系統(tǒng)，主要由四個(gè)模塊組成，包括進(jìn)樣模塊、微流控芯片模塊、液滴存儲(chǔ)和培養(yǎng)模塊以及液滴檢測(cè)和收集模塊。MISS Cell生成微升級(jí)單細(xì)胞液滴，在透氣性培養(yǎng)盤中儲(chǔ)存與培養(yǎng)液滴。培養(yǎng)完成后，通過光譜檢測(cè)和特定算法進(jìn)行液滴識(shí)別與基于OD檢測(cè)的自動(dòng)分選。MISS Cell采用特殊的機(jī)械結(jié)構(gòu)，通過液滴打印的方式與標(biāo)準(zhǔn)化容器，如96微孔板、8聯(lián)排PCR管等對(duì)接，實(shí)現(xiàn)液滴的自動(dòng)化收集（圖1）。  圖1  MISS Cell的結(jié)構(gòu)和原理示意圖。（a）MISS Cell的整體結(jié)構(gòu)；（b）液滴識(shí)別和OD檢測(cè)的原理；（c）液滴分選和收集。

文章通過分離和培養(yǎng)用兩種不同顏色熒光標(biāo)記的同種細(xì)菌的混合溶液，驗(yàn)證了微升級(jí)單細(xì)胞液的產(chǎn)生。通過使用三種不同的混合菌液（mCherry和sfGFP標(biāo)記的大腸桿菌，RFP和EGFP標(biāo)記的谷氨酸棒桿菌以及mCherry和YPet標(biāo)記的釀酒酵母）進(jìn)行廣泛的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)將泊松分布λ控制在0.035-0.145之間時(shí)，可確保產(chǎn)生較多的單細(xì)胞液滴，其占總液滴的3.4%-12.6%。MISS Cell的適用范圍包括常見的細(xì)菌、酵母、使用孢子繁殖的絲狀真菌和放線菌等（圖2）。  圖2  MISS Cell中單克隆培養(yǎng)和分選的操作流程和驗(yàn)證結(jié)果。（a）固體平板方法和MISS Cell培養(yǎng)方法的操作流程比較；（b）單細(xì)胞液滴生成的原理和雙色熒光菌體系驗(yàn)證原理；（c）使用紅色和綠色熒光標(biāo)記的大腸桿菌的驗(yàn)證結(jié)果，λ=0.086；（d）使用大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果匯總。

文章首次系統(tǒng)地探究了微升級(jí)單細(xì)胞液滴的各項(xiàng)性能。MISS Cell中微升級(jí)液滴具有良好的體積一致性，生成液滴的體積變異系數(shù)為1.88%。MISS Cell對(duì)液滴及其揮發(fā)性底物具有優(yōu)秀的保留能力，支持微生物的長(zhǎng)期培養(yǎng)。和微孔板、深孔板相比，微升級(jí)液滴具有良好的培養(yǎng)性能和微生物生長(zhǎng)一致性，有利于微生物的檢測(cè)和篩選。和固體平板相比，微升級(jí)液滴培養(yǎng)前期生物量增長(zhǎng)快于固體平板，有利于更早進(jìn)行單菌落的挑取，縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高工作效率（圖3）。  圖3  MISS Cell中微升級(jí)液滴性能表征。（a）生成液滴的體積變化；（b）液滴揮發(fā)情況；（c）液滴中底物（以甲醇為例）的揮發(fā)情況；（d）不同方法微生物培養(yǎng)的平行性；（e）微升級(jí)液滴和固體平板中單菌落生長(zhǎng)速率比較。Scale bar = 400 μm。

分子克隆的培養(yǎng)和挑取是合成生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)操作，通常使用固體平板進(jìn)行。文章使用MISS Cell來培養(yǎng)和挑選分子克隆，并通過測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰圖是否由單一或雜合峰組成，評(píng)估每個(gè)菌落的單克隆性。結(jié)果顯示，來自MISS Cell的單菌落的測(cè)序雜合峰比例為5.52%和4.35%，與固體平板的結(jié)果（2.50%和4.12%）相似，且都低于某生物公司的長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（7.68%）。這進(jìn)一步表明，MISS Cell中的微升級(jí)液滴培養(yǎng)物具有良好的單克隆性，可用于分子克隆的培養(yǎng)和挑�。▓D4）。 圖4  MISS Cell中分子克隆的培養(yǎng)和分選。（a）使用MISS Cell和固體平板方法進(jìn)行分子克隆的操作流程；（b）來自固體平板和MISS Cell的不同菌落的測(cè)序峰圖；（c）使用不同的DNA連接產(chǎn)物的測(cè)試結(jié)果。

文章建立了基于MISS Cell的微生物誘變篩選工作流程，并對(duì)Corynebacterium glutamicum B2H001進(jìn)行高谷氨酸（Glu）產(chǎn)量表型菌株的篩選。首先，使用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）處理C. glutamicum B2H001獲得突變體庫。接下來使用MISS Cell對(duì)突變體進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行單克隆菌落的分選。文章使用了一個(gè)基于強(qiáng)度的谷氨酸感應(yīng)熒光報(bào)告器（intensity-based glutamate-sensing fluorescent reporter，iGluSnFr）進(jìn)行Glu的特異性檢測(cè)。文章在3500個(gè)液滴中分選收到502個(gè)單克隆，檢測(cè)后選取了11株信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。最終驗(yàn)證得到的1J11和1P18突變體，搖瓶培養(yǎng)的谷氨酸產(chǎn)量分別提升了25.8%和19.1%。MISS Cell實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵流程的自動(dòng)化，即單克隆菌落的培養(yǎng)和挑取，具有很高的通量，并省去了單克隆再培養(yǎng)的步驟，節(jié)省了人力物力和時(shí)間（圖5）。  圖5  C. glutamicum B2H001在MISS Cell中的篩選流程和結(jié)果。（a）MISS Cell和傳統(tǒng)固體平板之間的菌種誘變篩選流程比較；（b）iGlusnFr檢測(cè)Glu的工作示意圖；（c）iGlusnFr對(duì)Glu的反應(yīng)曲線；（d）使用iGlusnFr作為傳感器在MISS Cell中培養(yǎng)的初始菌株的Glu產(chǎn)量時(shí)間曲線；（e）MISS Cell篩選和24深孔板的驗(yàn)證結(jié)果；（f）菌株1J11、1A2、1P18和1K1在搖瓶中的進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。

綜上，該研究工作開發(fā)的微升級(jí)單細(xì)胞液滴篩選系統(tǒng)（MISS Cell）自動(dòng)集成化平臺(tái)，可用于自動(dòng)化高通量微生物單克隆培養(yǎng)和挑選。與固體平板法相比，MISS Cell具有更高的產(chǎn)量、更低的試劑消耗和更多的自動(dòng)化操作，可以節(jié)省大量的人力和物力。與皮升級(jí)液滴相比，MISS Cell使用更簡(jiǎn)單的光學(xué)信號(hào)檢測(cè)，同時(shí)可以精準(zhǔn)識(shí)別液滴，使液滴可尋址（圖6）。MISS Cell有望成為一個(gè)通用的操作平臺(tái)，在高通量的應(yīng)用場(chǎng)景中大大提高單克隆菌落的獲取效率，解除固體平板在通量和操作上的限制，以促進(jìn)生物技術(shù)發(fā)展。  圖6 固體平板、皮升級(jí)液滴和MISS Cell培養(yǎng)的比較

論文鏈接:https://doi.org/10.1002/bit.28300
背景信息

高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)（single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics），是天木生物基于微升級(jí)液滴技術(shù)開發(fā)的微型化、高通量、自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)及分選裝備。本儀器單次運(yùn)行可完成約5000~10000個(gè)液滴的生成，并將液滴存儲(chǔ)于高透氣性管路中進(jìn)行培養(yǎng)，最后對(duì)液滴進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，并將目標(biāo)液滴分選至多孔板中。本儀器還具有培養(yǎng)體系均一性好、操作自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，還可以實(shí)現(xiàn)絲狀菌的培養(yǎng)；本儀器還可以對(duì)液滴進(jìn)行多種單元操作，豐富了檢測(cè)手段；儀器結(jié)構(gòu)緊湊，可以整體放入?yún)捬醪僮飨�，�?shí)現(xiàn)厭氧微生物的培養(yǎng)與篩選。本儀器用途廣泛，可以實(shí)現(xiàn)單克隆的自動(dòng)化生成與培養(yǎng)、及篩選，對(duì)各類環(huán)境樣本在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分離、培養(yǎng)、分選等（如環(huán)境微生物、腸道菌群等）。