研究進(jìn)展：偏振熒光顯微成像技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

熒光顯微技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，可對生命活動進(jìn)行細(xì)胞和亞細(xì)胞水平觀測。其基本原理是利用熒光探針標(biāo)記生物體內(nèi)特定結(jié)構(gòu)，通過探測熒光信號獲取相關(guān)信息。熒光的基本物理指標(biāo)包括強(qiáng)度、波長、時間和偏振等，其中對熒光偏振信息的利用及新型偏振熒光顯微成像技術(shù)的研發(fā)受到越來越多關(guān)注。自20世紀(jì)50年代以來，偏振熒光顯微技術(shù)不斷發(fā)展，涵蓋多種偏振調(diào)制技術(shù)和成像系統(tǒng)，其相關(guān)應(yīng)用拓展到細(xì)胞和亞細(xì)胞尺度，涉及多種生物結(jié)構(gòu)和生物體。

浙江大學(xué)光電科學(xué)與工程學(xué)院極端光學(xué)技術(shù)與儀器全國重點(diǎn)實驗室魏明哲團(tuán)隊從偏振熒光成像原理出發(fā)，對目前存在的多種偏振熒光顯微成像技術(shù)進(jìn)行原理介紹和現(xiàn)狀分析，列舉了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用，討論了其發(fā)展趨勢及前景，旨在為該領(lǐng)域的科研人員了解偏振熒光顯微成像技術(shù)提供參考。

偏振熒光成像原理
一、熒光的偏振特性
熒光物體吸收和輻射通常被視為各向同性，但實際采用偶極子或更高階模型對熒光偏振特性建模更準(zhǔn)確。從經(jīng)典物理學(xué)角度，熒光偶極子吸收過程的吸收率與激發(fā)光和吸收偶極矩夾角余弦值平方成正比，輻射電場與光傳播方向和輻射偶極矩有關(guān)，這體現(xiàn)了熒光吸收和輻射過程中能量分布不均一的偏振特性。

二、偏振成像調(diào)制方法
最初依據(jù)熒光輻射過程中的偏振特性（熒光各向異性），通過測量熒光偏振系數(shù)或各向異性系數(shù)來定量分析生物大分子取向信息及動態(tài)變化，但熒光分子旋轉(zhuǎn)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致去極化現(xiàn)象，影響測量。后來提出熒光線性二向色性偏振顯微成像技術(shù)，利用熒光吸收過程中分子對偏振光方向的選擇性來避免去極化影響，通過測定不同方向線偏振激發(fā)光對應(yīng)的熒光輻射強(qiáng)度之比測定生物樣本中偶極子取向信息及其動態(tài)變化。

三、偏振成像的空間-角度表征理論
熒光各向異性和線性二向色性偏振顯微成像技術(shù)在測量生物分子取向分布方面有一定應(yīng)用，但存在局限性，無法獲得整幅圖像中完整取向順序信息。2019年Chandler等提出空間-角度熒光顯微鏡基本理論，從希爾伯特空間出發(fā)對消球差透鏡建模，推導(dǎo)出成像模型，并采用球諧基對偶極子空間-角度成像模型進(jìn)行描述，實現(xiàn)了從偶極子取向二維平面解析到三維空間解析的跨越，對偏振顯微成像系統(tǒng)發(fā)展意義重大。

基于偏振調(diào)制的熒光顯微成像技術(shù)
一、寬場偏振熒光顯微技術(shù)
基于熒光線性二向色性的偏振顯微成像技術(shù)最早出現(xiàn)在寬場熒光顯微鏡中。2006年Vrabioiu等用其研究活酵母菌隔膜蛋白結(jié)構(gòu)；2011年DeMay等提出相關(guān)成像系統(tǒng)并用于測量綠色熒光蛋白偶極矩取向；2015年Abrahamsson等開發(fā)的MF-PolScope可實現(xiàn)多個偏振態(tài)和多達(dá)25個焦平面的同時成像，獲取瞬時三維圖像。

二、共聚焦偏振熒光顯微技術(shù)
共聚焦熒光顯微技術(shù)與偏振調(diào)制結(jié)合可更好地探測偶極子取向。2003年Bigelow等設(shè)計了可用于熒光各向異性成像的激光掃描共聚焦熒光成像系統(tǒng)；2013年Kress等提出共聚焦偏振熒光顯微技術(shù)，能量化細(xì)胞膜分子取向順序；Wang等后續(xù)改進(jìn)提高了采集速率，相關(guān)技術(shù)在巨型單層囊泡和COS-7細(xì)胞上得到驗證。

三、光片偏振熒光顯微技術(shù)
光片熒光顯微鏡具有獨(dú)特優(yōu)勢，光毒性和光漂白效應(yīng)小，軸向分辨率高且可三維快速成像。2018年Markwardt等首次將偏振熒光成像應(yīng)用于光片顯微技術(shù)，用于觀測活體線蟲胚胎；后提出雙視角倒置偏振光片熒光顯微技術(shù)，實現(xiàn)熒光分子三維空間強(qiáng)度和三維分子取向聯(lián)合重構(gòu)，但存在噪聲抑制相關(guān)問題，浙江大學(xué)課題組提出改進(jìn)方法，解決了現(xiàn)有方法的諸多問題。

四、雙光子偏振熒光顯微技術(shù)
2007年馬輝課題組利用熒光各向異性表征生物分子旋轉(zhuǎn)動力學(xué)和相互作用；2009年Gasecka等提出偏振雙光子顯微技術(shù)，可定量測量脂質(zhì)和細(xì)胞膜中局部靜態(tài)分子取向，具有諸多優(yōu)勢；Lazar等發(fā)現(xiàn)雙光子偏振熒光顯微鏡檢測靈敏度更高；Ferrand等從數(shù)學(xué)上證明了取向測量所需偏振測量次數(shù)，并提出相關(guān)數(shù)據(jù)處理方法完善了理論。

五、寬場超分辨分子取向顯微技術(shù)
偏振熒光顯微鏡受衍射極限影響，北京大學(xué)席鵬研究團(tuán)隊研發(fā)多種技術(shù)解決。2016年的SDOM技術(shù)可解析亞衍射極限體積內(nèi)偶極子有效取向；2019年的pSIM技術(shù)將偏振激發(fā)看作結(jié)構(gòu)化照明，提升了分辨能力；2023年提出的新型高速自偏振同步調(diào)制3DSIM系統(tǒng)和三維取向映射顯微技術(shù)，分別實現(xiàn)了三維高速超分辨成像和高時空分辨率下熒光偶極子三維取向測量。

六、單分子取向定位顯微技術(shù)
偏振調(diào)制用于單分子定位顯微鏡，早期通過激發(fā)光偏振變化激發(fā)分子線性二向色性進(jìn)行單分子二維取向估計，后引入多個照明角度估計三維方向，還可通過探測端偏振分裂獲取分子取向信息，但方向估計需校準(zhǔn)光學(xué)像差。2023年Zhang等開發(fā)的raMVR顯微鏡結(jié)合偏振探測和光瞳分裂技術(shù)，實現(xiàn)了單分子精度的六維成像，具有出色性能。

七、基于偏振調(diào)制的分辨率增強(qiáng)顯微技術(shù)
偏振可提升空間分辨率。2014年Hafi等提出SPoD技術(shù)，通過旋轉(zhuǎn)線偏振光激發(fā)和相關(guān)算法處理，提升了空間分辨率；2018年Zheng等開發(fā)P-TIRF顯微技術(shù)，通過偏振調(diào)制器實現(xiàn)快速偏振調(diào)制，提升了三維樣品結(jié)構(gòu)重建精度；此外，利用衍射圖案對熒光團(tuán)方向和位置的依賴性也可提高空間檢測精度，如Lew等研究發(fā)現(xiàn)偏振成像可抑制偶極子徑向偏振光，提高定位精度。

生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
一、膜類結(jié)構(gòu)觀測
早期利用偏振熒光顯微鏡測量生物分子轉(zhuǎn)動特征，如1990年Florine-Casteel成像單層囊泡測量脂質(zhì)順序；羰花青染料常用于標(biāo)記膜類結(jié)構(gòu)，1979年Axelord研究其在紅細(xì)胞膜中的取向；1990年Dix等測量細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)粘度；2013年Wang等測量COS-7細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；2023年Zhang等研究淀粉樣蛋白-脂質(zhì)相互作用，對研究神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制意義重大。

二、蛋白質(zhì)類結(jié)構(gòu)觀測
隔膜蛋白具有熒光偏振特性，2006年Vrabioiu等用寬場偏振熒光顯微鏡觀察活酵母隔膜蛋白，解決結(jié)構(gòu)爭議；2011年DeMay等確定其在活細(xì)胞中的組織情況；2015年Abrahamsson等揭示芽殖酵母細(xì)胞分裂中的蛋白質(zhì)組裝過程；2016年席鵬課題組實現(xiàn)活酵母細(xì)胞中隔膜蛋白和核孔復(fù)合蛋白的超分辨偶極子成像。肌動蛋白參與眾多細(xì)胞生命過程，2012年Vishwasrao等研發(fā)相關(guān)成像方法，2016年和2023年席鵬課題組分別實現(xiàn)其超分辨偶極子取向測量和精確測量分子結(jié)構(gòu)。微管在細(xì)胞中起重要作用，2023年席鵬課題組發(fā)現(xiàn)其新結(jié)構(gòu)特征，表明其與肌動蛋白和肌球蛋白協(xié)同作用促進(jìn)膜管化。

三、其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
熒光偏振可用于藥理學(xué)篩選測定，測量藥物-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用。Dubach等使用多光子熒光各向異性顯微鏡實現(xiàn)細(xì)胞和亞細(xì)胞尺度下活體實時體內(nèi)藥物分布和相互作用測量，2014年首次實現(xiàn)靶標(biāo)結(jié)合與未結(jié)合小分子藥物實時可視化；2016年Vinegoni等開發(fā)相關(guān)顯微鏡，在體外和小鼠腫瘤體內(nèi)具有高分辨率和深穿透能力，對新型藥物開發(fā)有重要指導(dǎo)意義。

總結(jié)與展望
偏振熒光顯微技術(shù)作為一種強(qiáng)大的成像工具，與傳統(tǒng)熒光顯微技術(shù)專注于熒光分子的位置和濃度信息不同，它能夠額外獲取生物分子的結(jié)構(gòu)取向信息，這一特性使其在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中占據(jù)著獨(dú)特且重要的地位。在單分子結(jié)構(gòu)研究中，它有助于深入了解分子層面的微觀結(jié)構(gòu)和相互作用；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方面，能夠為解析蛋白質(zhì)的組裝、功能發(fā)揮機(jī)制提供關(guān)鍵線索；對于生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的研究，更是可以揭示細(xì)胞膜的組成、動態(tài)變化以及與周圍環(huán)境的相互作用等奧秘。

然而，現(xiàn)有的偏振熒光顯微技術(shù)仍面臨諸多挑戰(zhàn)與局限。在分子三維取向觀測方面，盡管已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，如通過單分子取向成像和光片顯微成像技術(shù)在分子三維取向成像上有所突破，但目前大多數(shù)基于二維平面的分子取向觀測方法仍難以避免偏差。全面且精確的分子三維取向觀測，迫切需要更為優(yōu)化的偏振調(diào)制設(shè)計，以及在成像模型和圖像重構(gòu)理論方面的創(chuàng)新。

盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，但偏振熒光顯微技術(shù)的發(fā)展前景依然廣闊。隨著科技的不斷進(jìn)步，有望在理論研究、技術(shù)創(chuàng)新和實際應(yīng)用等多個方面取得突破，為生物醫(yī)學(xué)研究帶來更多的驚喜與發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步推動該領(lǐng)域向更深層次、更精準(zhǔn)化方向發(fā)展，從而為揭示生命活動的本質(zhì)和疾病的發(fā)病機(jī)制提供更有力的支持，也為新型藥物研發(fā)、精準(zhǔn)醫(yī)療等應(yīng)用領(lǐng)域開辟新的道路。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：魏明哲, 劉鈞宇, 郭敏, 劉華鋒. 偏振熒光顯微成像技術(shù)及研究進(jìn)展（特邀）[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(6): 0618011.