LaVision雙光子顯微鏡-腫瘤生長(zhǎng)與入侵動(dòng)態(tài)成像

Stephanie Alexander · Gudrun E. Koehl ·Markus Hirschberg · Edward K. Geissler · Peter Friedl

Accepted: 13 October 2008 / Published online: 6 November 2008

 

摘要：從首次感染部位向鄰近基質(zhì)的轉(zhuǎn)移入侵是腫瘤發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，研究成果較少。腫瘤入侵的原理以各種體外模型給出了實(shí)驗(yàn)性的表述；但是，體內(nèi)的關(guān)鍵性步驟和機(jī)制仍然不清楚。這里，我們通過(guò)落射熒光成像和多光子顯微鏡建立了一個(gè)修正的皮膚折疊室模型來(lái)闡述關(guān)于HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞的原位移植，生長(zhǎng)和入侵。這種策略允許對(duì)作為獨(dú)立細(xì)胞或者集體粘絲或者細(xì)胞團(tuán)沿著富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)和增補(bǔ)宿主組織包括紋狀肌肉絲和淋巴管的腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤誘導(dǎo)血管形成和入侵進(jìn)行重復(fù)成像。這個(gè)修正的窗口模型將適用于闡述腫瘤轉(zhuǎn)移和入侵的機(jī)制，以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)性治療。

 

    HT-1080雙色纖維肉瘤細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞質(zhì)DsRed2和核組蛋白2B（H2B）-EGFP –EGFP (Yamamoto et al. 2004)培養(yǎng)在改良的鷹培養(yǎng)基(PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany)中，補(bǔ)充10%的胎牛血清(Aurion, Wageningen, The Netherlands)，盤(pán)尼西林和鏈霉素（都100ug/ml;PAN)和潮霉素B（0.2mg/ml；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)在37%濕潤(rùn)的5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中。

 

    對(duì)于多光子顯微鏡，小鼠被用異氟烷麻醉并被穩(wěn)定固定在37℃的溫控平臺(tái)上。使用一個(gè)落射多光子顯微鏡，如(Friedl et al. 2007; Wolf et al. 2003)所描述，并配備了OPO裝置(OPO; APE, Berlin, Germany)用于1100nm波段的雙光子激發(fā)，以及紅外修正的20X/0.95N.A(Olympus)物鏡。如果沒(méi)有特定聲明，EGFP，DsRed2和SHG的獲取都是使用的832nm的激發(fā)光。由帶通濾波器確定的檢測(cè)光波段為400/40(藍(lán)），535/50（綠），605/70（紅），和710/75（紅外）。以5um的步長(zhǎng)對(duì)深達(dá)250um的成像深度進(jìn)行順序3D堆棧。通過(guò)向尾靜脈注射4mg熒光葡聚糖對(duì)血管顯影。在注射了淋巴歸巢環(huán)肽LyP-1（100ug）之后活化的淋巴管被檢測(cè)到。(Laakkonen et al. 2002)

 

    圖像被使用ImageJ 1.40 g (W. Rasband, NIH), ImSpector 3.4 (LaVision Bio- Tec GmbH), and Photoshop CS 8.0.1 (Adobe Systems Inc.)重構(gòu)和分析。以寬的平方X長(zhǎng)Xπ/6計(jì)算腫瘤體積。有絲分裂和細(xì)胞凋亡的比例通過(guò)H2B-EGFP模式從每區(qū)域30到100個(gè)細(xì)胞中確定。

 

Fig.1 在背側(cè)皮膚褶皺室中HT-1080纖維肉瘤細(xì)胞的滴落和注射方法比較.6（c）、7（d）天后通過(guò)明場(chǎng)和落射熒光顯微鏡觀察的細(xì)胞應(yīng)用，生長(zhǎng)位置（a，b）和宏觀腫瘤形態(tài)。在建立的模型中，允許細(xì)胞懸浮液或者細(xì)胞球粘附到外科手術(shù)準(zhǔn)備好的真皮組織表面上，獲得了在真皮層與蓋玻片（a.c）間的3D腫瘤生長(zhǎng)。使用細(xì)針將細(xì)胞球注射進(jìn)真皮中阻止蓋玻片和真皮內(nèi)產(chǎn)量增加間的反應(yīng)（b,d)。標(biāo)尺1mm（概圖）和250um（細(xì)節(jié)）

Fig 2. 腫瘤生長(zhǎng)階段。 a 由落射熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)的移植瘤生長(zhǎng)和入侵的時(shí)間進(jìn)程。新生血管的插入，不存在（3天）和存在（7天）。標(biāo)尺1mm。b 通過(guò)以day 1的體積進(jìn)行歸一化的腫瘤體積。mean+-SD（n=9）。c HT-1080移植腫瘤在6天的時(shí)候的腫瘤形態(tài)，血管化，分生和凋亡。使用多光子顯微鏡以激發(fā)波長(zhǎng)1100nm（左）和832nm（右）獲取的一個(gè)中央中流區(qū)域的3D重構(gòu)。核形態(tài)包括了有絲分裂（白色箭頭）和凋亡圖（黑色箭頭）。標(biāo)尺50um。插圖顯示了前相（P）、中相（M）和后相（LA）以及凋亡圖（A）。d 對(duì)時(shí)間依賴的分生和凋亡定量化。數(shù)據(jù)顯示3個(gè)非依賴性腫瘤的10-25個(gè)獨(dú)立區(qū)域的Mean±SEM

Fig 3. 近紅外多光子顯微鏡顯示環(huán)繞HT-1080雙色腫瘤的腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生血管及其結(jié)構(gòu)。Z軸為一個(gè)6天大腫瘤的從腫瘤邊緣（-50um）到腫瘤內(nèi)部區(qū)域（-80um）（紅色細(xì)胞質(zhì)；黃色細(xì)胞核）。通過(guò)FITC-葡聚糖注射現(xiàn)實(shí)的密布血管（綠），先前存在的線形血管（綠色箭頭）和不規(guī)則形狀的新生血管（藍(lán)色箭頭）。膠原纖維（黑色箭頭）和肌肉絲（白色箭頭），通過(guò)二次諧波檢測(cè)（灰度）。標(biāo)尺50um

Fig 4. HT-1080雙色細(xì)胞的原位入侵模型。a 注射后6天入侵類型的分類。缺少入侵（上，左）并且散布單個(gè)細(xì)胞（上，右；白色箭頭），散射的或者緊密地絲狀整體入侵（下圖）。標(biāo)尺250um。 b 45個(gè)連續(xù)的非依賴性腫瘤的按中所分入侵模式的頻率。11天時(shí)，沿著紋狀肌肉纖維集體入侵絲的定位。標(biāo)尺100um。d 單一細(xì)胞侵入脂肪組織隨后進(jìn)行分散的，部分整體的入侵。對(duì)照-少量圓的脂肪細(xì)胞（星號(hào)）被HT-1080細(xì)胞包圍。1100nm的激發(fā)光來(lái)檢測(cè)遍布的血管(Alexa Fluor 660-dextran,紅色),，腫瘤細(xì)胞質(zhì)（綠色假彩），SHG（灰度）；832nm用于腫瘤細(xì)胞核（白色）。標(biāo)尺100um

Fig 5. HT-1080細(xì)胞沿淋巴管的入侵。a 由多光子顯微鏡對(duì)邊緣而非腫瘤中心的活化淋巴管產(chǎn)生的單幅圖片。用FITC連接的LyP-1縮氨酸來(lái)檢測(cè)。深度已標(biāo)明在圖上（um）。b 3D堆棧投影表明淋巴管內(nèi)（白色箭頭）和外淋巴管入侵（黑色箭頭）。標(biāo)尺100um