實(shí)現(xiàn)蛋白marker與Annexin V雙染的同時(shí)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法

要用AnnexinV雙染法測(cè)凋亡，又想同時(shí)標(biāo)記蛋白marker，甚至還有胞內(nèi)指標(biāo)，可是PI和7-AAD都不能洗，怎么辦？

eBioscience的可固定細(xì)胞活力染料Fixable Viability Dye幫您完美解決

固定、破膜以及洗滌步驟不影響Fixable Viability Dye的染色，而PI、7-AAD的染色通常是放在其他抗體孵育完成后進(jìn)行，不能洗滌即要上機(jī)檢測(cè)；對(duì)于胞內(nèi)抗體的染色，由于經(jīng)過(guò)了固定步驟，經(jīng)過(guò)PI或7-AAD染色后所有的細(xì)胞都是陽(yáng)性，所以他們只適合于胞膜染色的死活細(xì)胞鑒定 
   
實(shí)驗(yàn)試劑
◎ Annexin V Apoptosis Detection kit (Cat. No. 88-8007, 88-8006, 88-8005, 88-8102, or 88-8008)
◎ 10X Binding buffer
◎ Annexin conjugated to APC, eFluor 450, FITC, PE or PerCP-eFluor 710
◎ Fixable Viability Dye eFluor® 660 (Cat. No. 65-0864), Fixable Viability Dye eFluor® 506 (Cat. No. 65-0866) or Fixable Viability Dye eFluor® 780 (Cat. No. 65-0865)
注意: Fixable Viability Dye eFluor® 450不推薦與AnnexinV檢測(cè)試劑盒同時(shí)使用
◎ Foxp3 Staining Buffer Set (Cat. No. 00-5523)
◎ Flow Cytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222)
◎ PBS (azide- and serum/protein-free PBS) 
   
試驗(yàn)方法   
1. 用蒸餾水稀釋 10X Binding Buffer 至 1X ；
2. 標(biāo)記表面marker；
3. 用不含疊氮鈉及血清的PBS洗細(xì)胞兩次；
4. 在不含疊氮鈉及血清的PBS按1-10x106 cells/mL 的濃度重懸細(xì)胞；
5. 每1mL細(xì)胞中加入 1 μL of Fixable Viability Dye并立即渦旋混勻；
6. 2-8°C避光孵育30分鐘；
7. 孵育完成后，務(wù)必用含蛋白的緩沖液，如Flow Cytometry Staining Buffer洗兩次細(xì)胞；
8. 用1X Binding Buffer洗一次細(xì)胞；
9. 在1X Binding Buffer中按1-5x106 cells/mL濃度重懸細(xì)胞；
10. 100 μL細(xì)胞懸液中加入5 μL熒光標(biāo)記的Annexin V；
11. 室溫避光孵育10-15分鐘；
12. 用1X Binding Buffer洗細(xì)胞一次；
13. 固定破膜，用破膜緩沖液洗細(xì)胞；
注意: 此時(shí)已經(jīng)不需要保持緩沖液中的鈣離子，因?yàn)锳nnexinV已經(jīng)結(jié)合到細(xì)胞表面了
14. 進(jìn)行胞內(nèi)marker的標(biāo)記；
15. 完成后上機(jī)分析。

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