細胞轉(zhuǎn)染的途徑與方法

瀏覽次數(shù)：5439　發(fā)布日期：2016-4-25　來源：南京厚百電子商務(wù)有限公司

細胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細胞的技術(shù),它是研究基因表達調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。細胞轉(zhuǎn)染分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中。

細胞轉(zhuǎn)染途徑

（一）物理介導(dǎo)：電穿孔法、顯微注射、基因槍

1. 電穿孔法：

電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)。本法需用特殊設(shè)置（電穿孔儀），把懸浮狀態(tài)的受體細胞和供體DNA共同放入皿中（或杯中），再施以高壓電脈沖，能夠促進DNA通過細胞膜而進入胞內(nèi)，并可整合到細胞的DNA中，使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。若轉(zhuǎn)移的DNA為帶有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，也可在選擇培養(yǎng)基中進行鑒定。

優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率較高

缺點：

1）需要昂貴的儀器（電穿孔儀）

2）對細胞的損害較大，每次轉(zhuǎn)染需要更多的細胞和DNA

3）每種細胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進行多次優(yōu)化：電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆轉(zhuǎn)地傷害細胞膜而裂解細胞。

2. 顯微注射

本法是借助顯微注射器直接把DNA注射入核內(nèi)，使之發(fā)生整合入受體細胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴密無菌的凈化室，以免敞開操作污染，同時要能有自動拉針儀以制備顯微針，一般用手動拉針器拉制時要能使針末端有一個0.6cm長的細部，太長易折斷，針尖開口為2-3μm間，針口小于1μm更佳，針尖開口大于5μm易刺傷細胞。

優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率較高，可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染。

缺點：在導(dǎo)入DNA時需要一個細胞一個細胞注射，不適合大量轉(zhuǎn)染細胞研究的需要。適用于制備轉(zhuǎn)基因動物

3. 基因槍

基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)。可以將大分子導(dǎo)入細胞。

（二）化學(xué)介導(dǎo)：磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)

1. 磷酸鈣共沉淀法

磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結(jié)合。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合，形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。

優(yōu)點：能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物，瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染都可以。

缺點：

1）轉(zhuǎn)染效率低：進入細胞的DNA只有1%-5%可以進入細胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩(wěn)定表達。

2）重復(fù)性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。

在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因為甚至偏離最優(yōu)條件的十分之一pH都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染失敗。

2. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體則不同，DNA并沒有欲先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細胞。

脂質(zhì)體（lipofectin regeant，LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1(w/w)]。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的特點：

1）適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞，可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

2）轉(zhuǎn)染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍。

3）能夠把DNA盒RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。

4）轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高。

5）轉(zhuǎn)染時最好不加血清和抗生素。

6）陽離子脂質(zhì)體細胞毒性相對較高，對部分細胞可能會干擾細胞的代謝。

3. 多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原理尚不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞核，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗。不適用與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時要除去血清。

（三）生物介導(dǎo)：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以病毒作為載體，通過病毒感染的方式將外源DNA導(dǎo)入到細胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染體系最為常用。

優(yōu)點：整合效率高，可使外源基因在宿主細胞中長期表達。適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細胞。

缺點：存在潛在的安全危險性。

1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

此系統(tǒng)包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細胞兩個部分。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進入包裝細胞系時，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，于是包裝細胞系就成了制造病毒載體的生產(chǎn)細胞系。將靶細胞與生產(chǎn)細胞系共同培養(yǎng)或是收集含有載體病毒的生產(chǎn)細胞系上清液與靶細胞一起孵育，即可有效地進行基因轉(zhuǎn)移。可以有效地整合入靶細胞基因組并穩(wěn)定持久地表達所帶的外源基因。

優(yōu)點：

1）轉(zhuǎn)染譜廣，可感染包括人體在內(nèi)的多種動物細胞類型

2）一次可感染大量細胞，轉(zhuǎn)染率可高達100%

3）轉(zhuǎn)染的基因能夠準(zhǔn)確整合到宿主細胞基因組中，整合率高，且能長期有效表達。

缺點：

1）載體的滴度較低

2）只能整合表達至分裂相細胞

3）容納的外源基因量較少，不利于較大基因的插入（<8kb）

2. 腺病毒載體的特點

1）在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因

2）能有效進行增殖，滴度高

3）不整合到染色體中，一般用于瞬時轉(zhuǎn)染