數(shù)字PCR法檢測(cè)基因突變和基因缺失

Drop-off數(shù)字PCR檢測(cè)方法的最主要優(yōu)勢(shì)是能夠能夠在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到基因組序列范圍短的同源基因突變（包括核苷酸的缺失，插入和替換）。簡(jiǎn)單來(lái)講，Drop-off實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)針對(duì)相同擴(kuò)增子的TaqMan 探針：與野生型序列互補(bǔ)而與突變位點(diǎn)不發(fā)生互補(bǔ)的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補(bǔ)的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off 探針和Reference探針都將與目標(biāo)雜交，產(chǎn)生雙重陽(yáng)性信號(hào)（如圖1B，藍(lán)色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個(gè)核苷酸的突變也會(huì)阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行退火，從而得到一個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。（如圖1B，綠色群）。

 

圖1信息說(shuō)明如下：

A. Drop-off和Reference探針及引物在目標(biāo)基因上的示意圖（FP：上游引物，RP：下游引物）

B. 2D圖中顯示來(lái)自雙陽(yáng)性野生型等位基因的熒光簇（天藍(lán)色：藍(lán)色和綠色）和單一的突變等位基因的熒光簇（綠色）和陰性微滴簇（黑色）。

C. 值得注意的是在微滴生成過(guò)程中，某些突變等位基因和野生型等位基因隨機(jī)分布在同一液滴中，所以同一個(gè)液滴會(huì)同時(shí)顯示野生型和突變型（天藍(lán)色：藍(lán)色和綠色）。野生型濃度可以直接由雙色通道中的陽(yáng)性液滴的比例獲得(第三個(gè)顏色通道的陰陽(yáng)性微滴數(shù)不影響濃度計(jì)算)。突變型濃度可以直接單陽(yáng)性微滴的比例獲得(第三個(gè)顏色通道的陰陽(yáng)性微滴數(shù)不影響濃度計(jì)算)，其中已經(jīng)刨除了雙陽(yáng)性液滴的數(shù)量。所以將雙陽(yáng)性液滴計(jì)算為突變陰性微滴，突變頻率可能會(huì)被低估。

可以通過(guò)以下方式獲取Drop off計(jì)算方法：

www.stillatechnologies.com/technical-notes 或Whale,AS,et al.,Biomol Derect Quantif. 2016 27:10:15-23獲取Drop off計(jì)算方法的更多信息。

Drop-off檢測(cè)KRAS，NRAS和EGFR熱點(diǎn)突變

在臨床應(yīng)用中，通常檢測(cè)一組有預(yù)測(cè)意義的遺傳標(biāo)記物跟蹤治療效果。例如：在非小細(xì)胞肺癌中，EGFR第19外顯子的缺失使其對(duì)第一代酪氨酸激酶抑制劑具有敏感性。在結(jié)直腸癌中，KRAS和NRAS原癌基因突變是EGFR抗體耐藥的重要指標(biāo)。使用Drop-off和Naica三色多重檢測(cè)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了三種包含內(nèi)部質(zhì)控對(duì)照（IC，Internal Control）的Drop-off數(shù)字PCR檢測(cè)方法，用于檢測(cè)最常見(jiàn)的KRAS 3號(hào)外顯子、NRAS 2號(hào)外顯子和EGFR 19號(hào)外顯子的基因突變情況（如圖2,3）。增加內(nèi)部質(zhì)控品（IC）可以評(píng)估由于樣本中的抑制劑，從而評(píng)估方法的穩(wěn)定性。

圖2信息說(shuō)明如下：

分別檢測(cè)7個(gè)和4個(gè)最常見(jiàn)的KRAS 12號(hào)外顯子和NRAS 3號(hào)外顯子突變，以及EGFR外顯子19缺失的Drop-off實(shí)驗(yàn)可靠性。在25ul PCR反應(yīng)體系中，以95%的置信度在連續(xù)稀釋范圍從5%到0.25%的突變DNA中可以檢測(cè)到最終濃度為1cp/ul的突變DNA。所有檢測(cè)均在104copis的野生型DNA 和400copies的內(nèi)部質(zhì)控（來(lái)源于ØX174噬菌體）中進(jìn)行，每個(gè)稀釋梯度進(jìn)行了3次重復(fù)。所顯示的置信區(qū)間是理論置信區(qū)間的均值，該置信區(qū)間是在95%置信區(qū)間上由取樣誤差和分區(qū)誤差組成。

 

A：三重實(shí)驗(yàn)中KRAS，NRAS和EGFR drop-off實(shí)驗(yàn)2D圖。模板用的是商品化DNA（KRAS和NRAS）和來(lái)自冷凍腫瘤組織的DNA（EGFR）。WT：野生型。

B：散點(diǎn)圖顯示加入DNA內(nèi)部質(zhì)控品ØX174時(shí)，三色通道中的熒光信號(hào)。

由于已知在KRAS和NRAS突變熱區(qū)中存在多種突變，EGFR 19號(hào)外顯子中存在不同長(zhǎng)度的缺失或者插入，Drop-off實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了用最少種類(lèi)的探針達(dá)到快速、經(jīng)濟(jì)、有效地同時(shí)篩查多種具有臨床意義的基因突變。如果需要，通過(guò)Drop-off實(shí)驗(yàn)確定某個(gè)樣本為突變體后，即可使用序列特異性探針進(jìn)行檢測(cè)，從而確定DNA樣本中存在的確切突變位點(diǎn)。

應(yīng)用亮點(diǎn)：

● Drop-off數(shù)字PCR檢測(cè)能夠同時(shí)檢測(cè)基因組熱點(diǎn)區(qū)域發(fā)生的多種突變

● Drop-off實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了使用至少種類(lèi)的探針，快速、經(jīng)濟(jì)、有效地篩選多種遺傳變異

Naica^TM數(shù)字PCR系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)加入內(nèi)部質(zhì)控品的同時(shí)，使用Drop-off檢測(cè)方法進(jìn)行臨床應(yīng)用中通常檢測(cè)的7種KRAS突變、4種NRAS突變和發(fā)生在EGFR19外顯子的缺失/插入。

數(shù)字PCR學(xué)堂

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