未來可期-CAR-T細胞療法的發(fā)展及展望

圖1：T細胞活化雙信號

CAR-T細胞療法治療的原理是通過基因工程技術(shù)將識別腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associated antigen,TAA) 的抗體可變區(qū)基因序列與胞內(nèi)信號區(qū)序列在體外進行重組(形成CAR),再通過病毒轉(zhuǎn)染方式將編碼CAR基因的重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)進已分離出的患者T淋巴細胞中，使T細胞表面表達能識別腫瘤抗原的受體蛋白，經(jīng)體外大規(guī)模培養(yǎng)擴增后表達特異性嵌合抗原受體的T細胞稱為CAR-T細胞[2]。由于治療使用的Ｔ細胞來源于患者的外周血細胞，整個治療過程沒有免疫排斥反應。當大量CAR-T細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后，CAR能特異性地識別靶向腫瘤細胞的抗原，活化后的Ｔ細胞可以殺傷腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的目的。

根據(jù)CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，對CAR的設(shè)計研究已經(jīng)進行到了第五代[3]。初代CAR設(shè)計相對簡單，由單鏈抗體通過跨膜區(qū)域與細胞內(nèi)信號傳導區(qū)免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM,Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)相連,ITAM通 常為CD3ζ或FcεRIγ,第一代CAR設(shè)計的信號域是單一的信號分子，而腫瘤細胞表面共刺激分子表達減弱或者缺失,因此CAR修飾的T細胞缺乏共刺激-第二信號的支持,T細胞激活后很快由于信號限制而喪失作用，這使得第一代CAR-T細胞在患者體內(nèi)抗腫瘤效果有限[4]。作為改進,二代CAR在前一代的基礎(chǔ)上引入了一個共刺激分子(如CD28，4-1BB，OX40等),用來激活第二信號，提供雙重活化信號從而加強CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷毒性，這明顯的改善了第一代CAR對T細胞激活不充分的缺點[5, 6]；三代CAR則在二代的基礎(chǔ)上引入多個共刺激分子(如CD28、CD137、OX40等)，多種共刺激分子相互組合可以增強Ｔ細胞內(nèi)的JNK、NK-kB等信號通路，使得T細胞表現(xiàn)出更強更持久的作用活性，這對增加T細胞的抗腫瘤活性、延長T細胞的增殖能力、生存周期及促進細胞因子(如IL-2、IFN-γ、TNF-α等)的分泌等方面均有顯著的提升。但臨床上第三代CAR研究較少，且三代CAR會造成T細胞刺激閾值降低，可能引起活化信號的泄露，從而誘發(fā)細胞因子釋放過量，因此具體作用是否比二代CAR效果好還需要進一步研究[7]。四代CAR屬于新型研究，相比三代CAR其整合了一個活化T細胞核因子轉(zhuǎn)錄相應元件，它可以使CAR-T細胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細胞因子(例如IL-12)，從而可以提高了T細胞在腫瘤微環(huán)境中的存活率，招募并活化其它免疫細胞進入腫瘤微環(huán)境中進行免疫應答[8]。五代CAR-T就是通用型CAR-T，它以基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計可以阻止人體發(fā)生排異反應的基因，并且可以進行異體Ｔ細胞的提前制備，隨時提供給患者。但就臨床應用來看，第二代CAR-T細胞療法仍為主流。圖2為CAR發(fā)展歷程圖。

2.CAR-T在實體瘤中的應用
相比于血液系統(tǒng)腫瘤，實體瘤中CAR-T的應用受到更多因素的限制，一方面，實體瘤發(fā)生部位不像血液系統(tǒng)散布全身，CAR-T細胞需抵達實體瘤病灶，并浸潤到腫瘤內(nèi)部，即使CAR-T細胞能夠浸潤到實體瘤內(nèi)部，也會面臨其內(nèi)部免疫微環(huán)境的抑制，影響T細胞正常發(fā)揮作用；另一方面，實體瘤內(nèi)部微環(huán)境存在偏酸、缺氧及營養(yǎng)缺乏等情況，也不利于CAR-T細胞發(fā)揮作用。此外，實體腫瘤缺乏較理想的特異性表面抗原，且具有不同的免疫抑制機制，因此CAR-T細胞免疫治療在實體瘤的療效不及血液腫瘤(特別是B細胞惡性腫瘤)，但其在神經(jīng)母細胞瘤、非神經(jīng)母細胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胰腺癌等腫瘤中取得了較好的療效。由June博士領(lǐng)導的小組在臨床實驗中，通過靶向間皮素(Mesothelin)的CAR mRNA瞬轉(zhuǎn)入病人T細胞中，回輸CAR-T細胞后，發(fā)現(xiàn)1例胰腺癌轉(zhuǎn)移的晚期病人和1例晚期間皮瘤病人，均獲得顯著治療效果，沒有任何脫靶毒性發(fā)生[9]。HER2基因是受體酪氨酸蛋白激酶家族的成員，在很多腫瘤細胞過表達并且在上皮細胞上也有表達，在臨床實驗中，已經(jīng)采用第二代CAR-T靶向HER2來治療表達HER2的腫瘤患者[10]。另外，由于腫瘤新生血管與腫瘤的生長轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，應用靶向新生血管中過表達的血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFＲ-2)的CAR-T細胞進行腫瘤免疫治療，能夠抑制小鼠不同的腫瘤生長，且對正常組織無明顯損傷，進而可以發(fā)揮間接抗腫瘤作用[11, 12]。

3.CAR-T 細胞療法面臨的挑戰(zhàn)
CAR-T細胞在腫瘤免疫治療方面擁有很多優(yōu)勢，它可以利用非限制性的形式特異識別和殺傷表達特定抗原的癌細胞，以單鏈抗體(single chain antibody fragment，scFv)作為抗原識別區(qū)段的CAR能夠識別不同種類的抗原，包括糖類和脂類等非蛋白抗原，腫瘤表面的脂類抗原也可以作為靶點，而不再僅局限于蛋白類抗原。這擴大了腫瘤抗原靶點范圍。此外，CAR-T細胞還可以分泌多種細胞因子實現(xiàn)其在體內(nèi)的持續(xù)增殖，對腫瘤細胞有特異識別殺傷作用，同時，這些細胞因子還可以改變腫瘤免疫微環(huán)境對免疫細胞的抑制作用。盡管有著諸多優(yōu)勢，然而，新療法不可避免的會產(chǎn)生一些新問題，特別是在治療過程出現(xiàn)的嚴重毒副作用，其中以細胞因子釋放綜合征(CRS)最頻繁、癥狀最突出。另外，脫靶效應、神經(jīng)毒性以及插入突變都會影響CAR-T的最終療效。

● 細胞因子釋放綜合征（CRS）
細胞因子釋放綜合征(Cytokine releasesyndrome，CRS)也稱為細胞因子風暴，它是CAR-T臨床應用中最顯著的不良反應，嚴重的CRS出現(xiàn)概率為27%~53%，常發(fā)生于接受細胞治療后6~20天[6, 13]。其發(fā)生機制是靜脈輸入CAR-T細胞后，在短時間內(nèi)清除腫瘤細胞的同時會產(chǎn)生大量的炎癥因子，如細胞因子、趨化因子，這些炎癥因子會引起炎癥反應導致組織損傷，甚至引起死亡。臨床表現(xiàn)主要有發(fā)熱、乏力、疲勞、心動過速、低血壓、毛細血管滲透綜合性以及心功能不全、彌漫性血管內(nèi)凝血等癥狀[14]。目前關(guān)于細胞因子風暴造成的不良反應，解決方案主要有：使用糖皮質(zhì)激素藥物(如氫化可的松)來抑制細胞因子分泌；使用靶向阻斷刺激細胞因子信號轉(zhuǎn)導通路的藥物（如IL-6受體抑制劑）[15]；引入可控性自殺基因(如caspase9或者HSV-TK)作為安全開關(guān)，在出現(xiàn)急性毒性時，可以快速誘導T細胞凋亡并逆轉(zhuǎn)GVHD。另外，有研究構(gòu)建一種默認為關(guān)閉狀態(tài)，只有在調(diào)控藥物作用下才會開啟的“On Switch”CAR-T細胞，用以控制CAR-T作用的時間和劑量，提高治療的安全性[16]。還有研究顯示，CRS 與疾病進程或腫瘤負荷相關(guān)，在疾病負荷高的患者體內(nèi)CRS更嚴重，因此在疾病惡化之前進行CAR-T回輸治療可降低CRS的風險[6]。

● 脫靶效應
脫靶效應是CAR-T療法最主要的毒副作用之一。CAR-T細胞與腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen, TAA)具有高度的親和性，當正常組織與腫瘤細胞都表達同一種抗原時，CAR-T細胞無法區(qū)分，在攻擊腫瘤細胞的同時會攻擊正常細胞。如果靶抗原分子是嚴格的腫瘤特異性表面分子，就可避免脫靶效應的發(fā)生，但真正的腫瘤特異性分子到目前還非常少，因此，尋找僅表達于腫瘤細胞表面的靶抗原是CAR技術(shù)應用的首要任務(wù)。此外，通過設(shè)計多個抗原復合的CAR結(jié)構(gòu)，識別抗原組合，提高殺傷的特異性也可降低脫靶效應的發(fā)生概率，比如同時靶向抗原ErbB2和MUC1的CAR-T治療乳腺癌。腫瘤細胞的基因常常不穩(wěn)定，一旦靶抗原丟失就會逃離CAR的識別，而間質(zhì)細胞是腫瘤微環(huán)境的重要組分，直接影響腫瘤細胞，且基因表達相對穩(wěn)定，故有研究選擇基質(zhì)細胞作為CAR殺傷對象，間接作用腫瘤細胞，以應對腫瘤細胞基因不穩(wěn)定突變。

● 神經(jīng)系統(tǒng)毒性
接受CAR-T治療的B-ALL患者中29%~43%可發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)不良反應[17]。CAＲ-T治療白血病也可能引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。臨床研究報道這種神經(jīng)系統(tǒng)毒性表現(xiàn)多樣，如譫妄、嗜睡、語言障礙、運動障礙、不同程度的腦病癥狀和癲癇發(fā)作[2, 18]。Maude等在接受CAR-T治療的B-ALL患者腦脊液中發(fā)現(xiàn)了CAR-T，提示神經(jīng)毒性可能與患者腦脊液中出現(xiàn)CAR-T細胞相關(guān)[2]。此外，JUNO公司進行的JCAＲ015Ⅱ期臨床試驗中， 在20余例患者中先后有3例出現(xiàn)因神經(jīng)毒性作用導致的死亡事件；分析認為患者可能存在白血病細胞入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(Central nervous system leukemia，CNSL)，導致CAR-T細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞，大量腫瘤細胞短時間內(nèi)在腦組織中迅速裂解，從而形成腦部水腫; 因此在臨床治療中應排除CNSL患者。CAR-T治療引起的神經(jīng)毒性癥狀通常是自現(xiàn)性的，多數(shù)患者神經(jīng)系統(tǒng)障礙可在短期內(nèi)恢復，且沒有后遺癥。使用妥珠單抗或皮質(zhì)類固醇激素無法明顯緩解神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，其背后的發(fā)生機制未明。

● 插入突變
CAR-T技術(shù)是在T細胞中插入一段外源的DNA片段，理論上說其結(jié)構(gòu)已被破壞，存在一定的致瘤風險。雖然目前并沒有關(guān)于基因改造T細胞致瘤性的報道，但研究者還是一直關(guān)注此問題的發(fā)生，也在不斷通過優(yōu)化載體的類型和轉(zhuǎn)染的方式來降低插入突變的風險，某些研究中心已采用mRNA直接轉(zhuǎn)導T細胞的方法來避免風險的發(fā)生[19]。此外，CAR-T療法存在其它的不良反應，包括：過敏反應，移植物康宿主病(GVHD)，腫瘤溶解綜合征等。

4.CAR-T細胞療法未來發(fā)展趨勢
一是治療效果待提高。僅從短時間內(nèi)的治療效果看，CAR-T療法對某些血液腫瘤的治療效果十分顯著，但若將觀察期限進一步延長則發(fā)現(xiàn)，許多患者在經(jīng)過CAR-T治療幾個月或更長時間后，會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)的現(xiàn)象，影響患者預后。因此提高CAR-T細胞激活程度，提高其增殖能力，并延長CAR-T細胞在患者體內(nèi)的存活時間是未來研究的重點方向之一。針對經(jīng)CAR-T治療后血液腫瘤可能再次復發(fā)的風險，我們可以設(shè)計同時靶向CD19與CD22分子的雙特異性CAR-T，已有研究發(fā)現(xiàn)，在CAR-T治療過程中，一些原本表達CD19的癌細胞可能轉(zhuǎn)而表達CD22蛋白，因此CD19、CD22雙管齊下，理論上能夠增強CAR-T的效果。當前，改善CAR-T療法在實體瘤中的治療效果面臨巨大的阻礙。
二是CAR-T的產(chǎn)業(yè)化。CAR-T療法費用昂貴。目前，已獲批的CAR-T產(chǎn)品和絕大多數(shù)CAR-T臨床試驗都是使用自體型CAR-T，即以患者自身的T細胞為起始材料，這種“私人訂制”療法的生產(chǎn)成本較高。諾華、Kite 獲批的CAR-T 產(chǎn)品定價分別為47.5萬美元、37.3萬美元，高昂的價格限制了其市場潛力。諾華旗下的CAR-T產(chǎn)品在2018年第一季度取得了1200萬美元的營收，只達到了預期的三成；Kite的CAR-T產(chǎn)品在獲批后兩個月內(nèi)的銷售額也不及預期。除費用高昂外，CAR-T療法質(zhì)量穩(wěn)定性也比較差。患者自身的T細胞通常都存在質(zhì)量與數(shù)量的缺陷，不同批次產(chǎn)品之間質(zhì)量的穩(wěn)定性較差，難以達到大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)及標準化的質(zhì)量控制。
三是降低CAR-T細胞毒性。CAR-T療法表現(xiàn)出的毒副作用說明，需要開發(fā)一些控制程序來調(diào)控CAR的活性。目前已經(jīng)有大量方法用于控CAR-T的安全性，比如通過安裝自殺開關(guān)對移植細胞進行快速清除，這種開關(guān)可通過小分子或者抗體來控制。常用的自殺開關(guān)包括可誘導的caspase-9(iCasp9)、單純皰疹病毒中的胸苷激酶(HSV-TK)及自殺表位等。但自殺開關(guān)也會清除治療性的CAR-T細胞，引發(fā)治療反應的不可逆終止。因此，不清除CAR-T細胞的非細胞毒性的可逆系統(tǒng)對于控制毒性反應也許是有用的。
四是開發(fā)通用型CAR-T。目前全球主要有十幾家公司從事通用型CAR-T開發(fā)。該技術(shù)主要依賴于基因編輯平臺，使用CRISPR技術(shù)敲除T細胞中引起免疫排斥的基因，將其制成沒有免疫排斥的、只特異性殺傷腫瘤細胞的標準化T細胞，使CAR-T轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;off-the-shelf”的藥品，與高成本“私人定制”的CAR-T不同，通用型CAR-T將會具備能規(guī)�；�生產(chǎn)、劑量恒定、療效優(yōu)越等優(yōu)點。目前，雖然大多數(shù)通用CAR-T的研發(fā)還處在臨床前或臨床早期階段，但其極具吸引力的治療潛力足以作為繼續(xù)研發(fā)的強大推動力。通用型CAR-T的上市將會大大降低CAR-T療法的成本，使這項技術(shù)惠及更多的病人。
CAR-T細胞療法是一直免疫細胞治療領(lǐng)域的焦點，極有希望徹底改變某些腫瘤(特別是血液腫瘤)的臨床治療現(xiàn)狀，美國是全球最早開啟CAR-T細胞治療臨床實驗的國家，2010年以前，全球CA-T細胞治療臨床注冊實驗都集中在美國開展，我國從2012年起開始了CAR-T細胞治療臨床注冊，每年新注冊的CAR-T項目以數(shù)倍的速度爆發(fā)式增長，目前已成為全球CAR-T細胞療法臨床實驗注冊數(shù)量最多的國家，但是CAR-T細胞療法在技術(shù)上和臨床應用上仍然存在著許多亟待解決的問題。希望通過醫(yī)藥企業(yè)、臨床醫(yī)生、政府監(jiān)管部門三方共同努力，建立高水準的標準化治療流程以及制定一系列的法規(guī)政策，推動我國CAR-T細胞治療技術(shù)臨床應用的快速發(fā)展，為醫(yī)學發(fā)展和人類健康做出貢獻。

圖3：CAR-T生產(chǎn)過程

5.CAR-T研究相關(guān)產(chǎn)品

1）CAR-T活化：CD3和CD28激發(fā)型抗體

2）CAR-T擴增：無動物成分重組細胞因子

3）CAR-T鑒定：預包被的ELISA試劑盒

 參考文獻