光片技術小課堂四 —— 數(shù)據(jù)的獲取

上一次锘海光片技術小課堂簡單介紹了樣本的放置，這次將會繼續(xù)往下介紹數(shù)據(jù)的獲取。

 

4.數(shù)據(jù)的獲取

由于每種顯微鏡各自不同的特點，用戶的使用體驗也是不同的。光片顯微鏡的使用體驗可能感覺與傳統(tǒng)顯微鏡特別不同，因為大多數(shù)設置都是完全數(shù)字化的，沒有目鏡，所以無法通過眼睛快速檢查樣品的位置和方向。此外，位移臺的控制可能與傳統(tǒng)顯微鏡的界面也有很大不同�？焖賿呙铇悠氛麄�深度的能力，無需像共聚焦顯微鏡那樣等待掃描完成，使得光片顯微鏡的工作流程快速且直接。同樣，快速的數(shù)據(jù)獲取速度使得實驗能夠快速連續(xù)地進行。然而，快速的數(shù)據(jù)獲取會導致大量數(shù)據(jù)迅速積累，用戶需在謹慎考慮數(shù)據(jù)存儲與數(shù)據(jù)處理能力的情況下方可進行長時間拍攝。

 

4.1確定樣本方向

在普通的寬場熒光顯微鏡中，安裝好的樣品被放置在顯微鏡臺上，然后從上面或下面（垂直或倒置）進行照明和檢測。光片顯微鏡由于可以擁有不同的照明路徑，給樣品的放置增加了另一個自由度，從而允許用戶準確定位樣品。此外，多組數(shù)據(jù)可以從不同的路徑獲得，并拼合在一起，也能使顯微鏡的穿透深度固定的情況下獲得更大的成像范圍。同時，在光片顯微鏡中，樣品的放置方向也比經(jīng)典的單透鏡顯微鏡更為重要。用戶需要使樣品相對于照明軸和檢測軸方向正確：光片需要在不通過樣品的高折射或高吸收結構的情況下到達感興趣的區(qū)域。

 

4.2光片校準

與傳統(tǒng)熒光顯微技術不同的是，圖像采集過程中的第一個關鍵步驟是光片的校準。在光片顯微鏡中，我們需要辨別調(diào)整光片的基本參數(shù)，即高度和厚度，以及正確地將光片定位在檢測透鏡的焦平面上。這三個步驟對于獲得光片好的層析能力以及可靠性、一致性高的結果都是必不可少的。此外，光片的校準和對其參數(shù)的了解可能是決定進一步實驗策略的關鍵性先決條件，例如調(diào)整軸向的步進和之后的分析步驟。

 

① 調(diào)整光片的寬度

光片需要覆蓋視野的整個寬度，在使用掃描光片的情況下，可以通過設置掃描振幅較容易地調(diào)整此屬性。如果是靜態(tài)光片，則必須擴大照明光束。入射光束的強度分布通常遵循高斯模式，只有光束的中心部分被認為是均勻的。對于光片寬度的限制通常使用狹縫光闌，以避免視野之外不必要的激光輸入。

② 調(diào)整光片的厚度

如之前所說，光片的厚度定義了軸向光學截面的范圍。光片越薄，沿光束傳播軸的束腰范圍越小，因此可用視野越�。▓D2-1A和B）。這些光片特性通常由光學元件決定，通常在儀器的設計過程中進行選擇。用戶只需在實驗前確認光片的的正確校準即可（圖4-1A）。

③確認光片位置

一旦決定了來為所需視野提供光片的照明物鏡，則需要對光片進行校準。第一步是沿著光片射入的方向平移光片，直到它在視野中居中（圖4-1B）；第二步是要使光片在檢測路徑的焦平面上（圖4-1C）；第三步需要確認光片在整個視野內(nèi)與焦平面重疊（圖4-1D）。

 

 

圖 2-1 光片的特性與生成（A）薄薄的光片只能在小范圍內(nèi)產(chǎn)生均勻的光照；（B）相比之下，只有較厚的光片才能獲得較大的視野；（C）光片可以由圓柱形透鏡一維聚焦激光束（靜態(tài)光片）或通過快速掃描激光束穿過視場（掃描光片）生成。

 

 

圖4-1 光片校準（A）（從上方）校準良好的光片；（B）光片束腰位置需要在視野中央；（C）光片需要精確地放置在檢測物鏡的焦平面上；（D）照明軸需要與檢測軸正交。

 

 

 4.3選擇正確的成像參數(shù) 

光片顯微鏡具有速度快、光毒性低的特點，可以在不影響樣品的情況下對多個平面或多個時間點進行成像。雖然人們可能會追求更高的空間和時間分辨率，但產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量是巨大的；因此，需要有數(shù)據(jù)存儲和強大的計算能力來處理和歸檔數(shù)據(jù)。與其他顯微鏡技術相比，在使用光片顯微鏡時，用戶需要在實驗前考慮必要的信息量。

 

 

需要考慮的采集參數(shù)有：

• 光片厚度

• 軸向步進

• 相機的曝光時間和區(qū)域

• 激光照明功率

• 拍攝幀速

• 多視圖采集

 

用戶需要在圖像質(zhì)量和數(shù)據(jù)大小之間找到適當?shù)钠胶狻］^薄的光片提供了好的軸向分辨率，但需要拍攝更多數(shù)量的圖片。較短的曝光時間和光照時間可以減少移動樣本時的運動模糊，提高時間分辨率，但在相同的信噪比下，每幀需要更高的激發(fā)能量，意味著需要使用更高的激光功率。同時，提高幀速會在提高時間分辨率的同時也會增加數(shù)據(jù)量。光片顯微鏡的一個特點是能夠從不同方向拍攝樣本，當拍攝的樣品太大而無法從一個方向完成成像時會非常有用。多視圖采集后的三維重構還能在一定程度上彌補單向成像中由于光片在樣品內(nèi)受到影響導致的瑕疵和失真，從而達到提升分辨率的效果。

 

 

參考文獻：

1.Huisken,J., & Stainier, D. Y. R. (2007). Even fluorescence excitation bymultidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). OpticsLetters, 32(17), 2608–2610.

2.Preibisch,S., Saalfeld, S., Schindelin, J., & Tomancak, P. (2010). Software forbead-based registration of selective plane illumination microscopy data. NatureMethods, 7(6), 418–419. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth0610-418.