iTRAQ/TMT標簽結構以及相對定量原理詳解

導讀
• iTRAQ/TMT定量蛋白組學技術
• iTRAQ/TMT標簽分子組成
• iTRAQ/TMT技術原理

iTRAQ和TMT標簽介紹
說到iTRAQ和TMT很多人可能會以為這是兩中不同的定量組學技術，但其實呢，iTRAQ和TMT技術只是生產商不同，除了標記規(guī)格和標簽分子結構有些許差異，標記肽段的原理基本上是一樣的。其中iTRAQ由AB SCIEX所開發(fā)，緊接著Thermo Fisher研發(fā)了TMT，二者只是專利不同，但是使用原理基本一致。

iTRAQ：Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation

TMT：Tandem Mass Tag

iTRAQ-TMT標簽結構以及相對定量原理詳解－百泰派克生物

iTRAQ和TMT標記實質上就是一種化學體外標記試劑，能夠特異性標記蛋白質酶解產生的多肽。iTRAQ和TMT標記的蛋白樣品規(guī)格不同，相比之下TMT能夠標記更廣泛的樣品數，能夠同時定量分析多組蛋白樣品，少至2個蛋白樣品，多至10個蛋白樣品，TMT蛋白定量都能夠做到。通過標記多組不同樣品，TMT和iTRAQ能夠同時比對正常組織樣品和腫瘤組織樣品的蛋白水平差異，以及精準檢測腫瘤在發(fā)展的不同階段的蛋白水平變化。

雖然iTRAQ和TMT的標記原理一樣，但是兩種標簽的結構卻有一些差異，接下來我們來看看ITRAQ和TMT的標簽結構一個各自的細微差異吧

iTRAQ與TMT的分子結構比較

iTRAQ與TMT的分子結構比較

從上圖來說，我們可以看到iTRAQ和TMT標簽在結構上有著明顯的差異，但是也有著一些共同點，首先兩個標簽都由報告基團，平衡基團以及肽反應基團組成，兩個標簽的各自報告基團和平衡基團的總重都是一定的。另外，兩個標簽的肽反應基結構也是一樣的。iTRAQ和TMT標簽的差異在于平衡基團的結構，從下圖可以看到TMT的平衡基團結構比iTRAQ標簽的更為復雜。iTRAQ標簽的平衡基團只有幾十Da，而TMT的平衡基團接近200Da，這也是造成iTRAQ和TMT標簽質量差異的原因。

簡單介紹完兩個標簽的結構后，我們再以iTRAQ 4-plex標簽為例，詳細認識一下iTRAQ分子標簽的結構組成

iTRAQ分子結構組成

iTRAQ 4-plex標簽結構

iTRAQ標簽分子骨架由三部分核心組件構成：報告基團，平衡基團和肽反應基團。其中，報告基團和平衡基團構成等基團。不同的iTRAQ標簽的報告基團的重量不同，4-plex標簽的報告基團重量分別是：114，115，116，117Da；平衡基團的質量分別是：31，30，29，28Da，使得4個iTRAQ標簽的報告基團總重都是145Da。另外一個核心組件就是肽反應基團，其主要的功能就是與多肽游離的N端氨基發(fā)生置換反應，使同位素標簽共價交連到肽段N端。
前面說到標簽報告基團和平衡基團的質量，很多人可能會好奇，標簽的報告基團僅僅相差幾個Da，這是如何做到的呢？其實這就是利用了同位素標記的原理。下面我們以iTRAQ標簽為例進行解釋。

如下圖，質量為114的報告基團包含1個C13，報告基團質量增加1Da。同時平衡基團包含1個C13和1個O18，質量總共增加3Da，因此，114標簽的總質量增加4Da。以此類推，115的報告基團增加2Da，平衡基團增加2Da；116的報告基團增加3Da，平衡基團增加1Da；117的報告基團增加4Da，平衡基團增加0Da。以上四個標簽通過對報告基團和平衡基團進行不同的同位素標記后，各自的報告基團和平衡基團的增加質量不同，但是增加的總的質量是一樣的，因此，標簽的總重相等。

iTRAQ標簽的同位素標記

標簽與肽段反應的過程

肽段標記反應過程

iTRAQ相對定量研究原理
蛋白質首先被裂解為肽段，然后用iTRAQ試劑進行差異標記。由于iTRAQ試劑是等量的，即不同同位素在標記同一多肽后在第一級質譜檢測，分子量完全相同，用串聯(lián)質譜方法對在第一級質譜檢測到前體離子進行碰撞誘導解離，產物離子通過第二級質譜進行分析。在二級質譜分析過程中，報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂，質量平衡基團丟失，產生低質荷比(m/z)的報告離子。由于二級質譜可分析相對分子質量相差1的報告基團，不同報告基團離子強度的差異就代表了它所標記的多肽的相對豐度。同時，多肽內的酰胺鍵斷裂，形成一系列 b 離子和 y 離子，得到離子片段的質量數，通過數據庫查詢和比較，可以鑒定出相應的蛋白質前體。

iTRAQ定量分析原理

iTRAQ相對定量研究流程

iTRAQ定量分析流程

1. 對不同的蛋白質樣品進行酶切消化成多肽片段
2. 使用不同的iTRAQ標簽對不同蛋白樣品消化產生的多肽片段分別進行標記，但是不同的iTRAQ標簽的總質量是一樣的。
3. 比例混合各個標記后的樣品
4. 帶上標記的多肽片段經過一級質譜分離，在一級質譜中，iTRAQ標簽由于總質量數一樣，來自不同蛋白樣品的相同肽段不能被區(qū)分，因此會一起進入二級質譜分析
5. 在二級質譜中，在高能碰撞下iTRAQ的平衡基團會被打碎，因此報告基團得到釋放，同時肽段也被釋放，碰撞碎裂成二級碎片。這時通過分析肽段的氨基酸序列，可以推測對應的蛋白質的序列；同時各個報告基團的在質譜中的信號強度代表多肽在4組樣品中的相對豐度，即反應相應的蛋白質在4組樣品中的相對表達水平。

百泰派克技術平臺

檢測分析平臺：多臺高分辨率質譜儀、高效液相色譜、氣相色譜，NMR。

蛋白質組分析平臺：Label-free、iTRAQ、SILAC、SWATH、MRM；蛋白質定性定量鑒定、蛋白質差異分析、發(fā)現(xiàn)疾病標記物、發(fā)現(xiàn)藥物靶標。

代謝組分析平臺：靶向代謝組學、非靶向代謝組學、脂質組學分析；通量達1000種代謝分子、代謝通路分析、代謝靶標鑒定。流式細胞多因子檢測平臺：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細胞因子。

蛋白質從頭測序平臺：Obitrap Fusion Lumos質譜儀、PEAKS軟件分析；100%序列測定，精準蛋白、抗體測序。

生物制藥分析平臺：生物藥物鑒定、變異性分析、純度分析。

流式細胞多因子檢測平臺：CBA、FlowCytomix；微量樣品需求，分析多種細胞因子。