naica微滴芯片數(shù)字PCR在準(zhǔn)確檢測精細(xì)胞中tRFs差異表達(dá)的應(yīng)用

導(dǎo)讀

除了在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外，tRNA可以被切割成較短的生物活性片段，稱為tRNA片段（tRFs）。來自精細(xì)胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代謝紊亂。因此，種系細(xì)胞中的tRFs是表觀遺傳的一種機(jī)制，然而壓力和毒素會(huì)導(dǎo)致tRFs模式的改變。華盛頓大學(xué)婦產(chǎn)科臨床研究部的研究人員在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上發(fā)表題為《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究對(duì)注射阿片類藥物（一個(gè)重要的壓力源）是否會(huì)影響生殖細(xì)胞中的tRFs感興趣。研究者對(duì)來自注射阿片類藥物病人(PWID)和非藥物使用對(duì)照組精液來源外泌體及精母細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序。測序后采用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，該技術(shù)的應(yīng)用為藥物濫用相關(guān)生育問題的研究提供了新的策略和方法。
 

阿片類藥物濫用對(duì)生殖系統(tǒng)的影響一直備受關(guān)注。近期一項(xiàng)研究揭示了注射阿片類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體的變化。該研究通過數(shù)字PCR技術(shù)檢測tRNA-Gly-GCC外泌體，發(fā)現(xiàn)未注射阿片類藥物的男性與注射阿片類藥物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌體存在顯著差異。
 

tRNA-Gly-GCC外泌體在精子發(fā)生和成熟過程中扮演關(guān)鍵角色。研究結(jié)果表明，這些差異可能與精子質(zhì)量和生育能力的下降有關(guān)。naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)在本研究中的應(yīng)用，不僅提供了高靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測方法，對(duì)揭示阿片類藥物對(duì)生殖系統(tǒng)的影響具有重要意義。
 

應(yīng)用亮點(diǎn)：

▶  naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)可以在RNA濃度低于檢測下限的樣品中檢測兩種tRFs形式。

▶ naica^®微滴芯片數(shù)字PCR結(jié)果與RNA測序結(jié)果具有很好的相關(guān)性，但比測序具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，有助于深入了解長期使用阿片類藥物的生物學(xué)影響。
 

研究結(jié)果：

▲圖１.男性長期使用阿片類藥物導(dǎo)致精子中tRF-Gly亞型比例的變化,使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)定量tRFs。成熟精子細(xì)胞通過45-90% Percoll梯度純化，并使用核苷素試劑盒分離小RNA。cDNA使用一種特定的莖環(huán)RT引物與“長”tsRNA亞型（53個(gè)核苷酸長）或另一種靶向“短”tsRNA變體（32個(gè)核苷酸長）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“長”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亞型的濃度。（C）“長”與“短”tRF Gly-GCC亞型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的濃度。“C”：對(duì)照組（不注射藥品的男性）;“PWID”：阿片藥物注射組。P值通過單尾曼-惠特尼U檢驗(yàn)計(jì)算。對(duì)照組：n=10，PWID組：n=13。

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中超過90%的reads到較短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的讀數(shù)。相比之下，對(duì)照組中只有4.1%的reads到更長的tRF，而PWID為45.6%。PWID的長/短tRF比顯著高于對(duì)照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)精液來源的外泌體中小核仁RNA（snoRNA）表達(dá)差異。盡管無法確立PWID的發(fā)現(xiàn)與阿片類藥物使用之間的直接聯(lián)系，但研究表明阿片類藥物注射和/或相關(guān)多藥使用習(xí)慣和生活方式改變可能會(huì)影響表觀遺傳。這為阿片類藥物使用的可遺傳影響提供了證據(jù)，并為進(jìn)一步研究其跨代健康影響的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

數(shù)字PCR技術(shù)在研究PWID中差異表達(dá)的tRFs方面發(fā)揮了重要作用。由于精液中含有復(fù)雜的細(xì)胞混合物，意味著其中含有抑制劑，對(duì)于PCR的擴(kuò)增有很大影響。但數(shù)字PCR有抗抑制劑干擾的特點(diǎn)，所以對(duì)于這類復(fù)雜樣本的檢測更為適用。文章中數(shù)字PCR和測序各自發(fā)揮了作用：測序用于發(fā)現(xiàn)長tRF和短tRF，而數(shù)字PCR則準(zhǔn)確檢測了tRF片段的表達(dá)差異，進(jìn)而驗(yàn)證了測序的結(jié)果。這一發(fā)現(xiàn)表明，數(shù)字PCR在研究tRFs和其他非編碼RNA片段方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。數(shù)字PCR不僅可以在tRFs和其他類似的研究中提供更為精確的結(jié)果，還可以在諸如癌癥、遺傳學(xué)和傳染病等領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。

原文鏈接如下：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9976897/
 

naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。