甲基化測(cè)序

 簡(jiǎn)介

(1) 流水線式流程：多功能PyroMark Q24可與表觀遺傳學(xué)和基因分析流程無(wú)縫結(jié)合，且與QIAGEN先進(jìn)的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增技術(shù)相兼容；流水線式的流程意味著可更快速地獲得結(jié)果。

(2) 快速簡(jiǎn)便：從PCR產(chǎn)物到單鏈樣品直接用于測(cè)序，應(yīng)用PyroMark Q24真空底座可在15分鐘內(nèi)同時(shí)制備24個(gè)樣品，使用該工作站操作簡(jiǎn)單，且手動(dòng)時(shí)間少于5分鐘。

(3) 自動(dòng)化分析：PyroMark Q24軟件包含兩種分析模式：CpG和 AQ（等位基因定量分析）。這兩種模式可在同一個(gè)板上分析，支持同時(shí)分析不同類型的樣品。AQ模式可用于分析單個(gè)和多元位點(diǎn)以及二、三和四等位基因突變；CpG模式可用于分析多重連續(xù)CpG位點(diǎn)，提供亞硫酸氫鹽處理的內(nèi)參。

樣品要求：

1) 樣品純度：OD 260/280值應(yīng)不小于1.6；260/230值不小于1.6；全基因組DNA無(wú)降解 
2) 樣品濃度：最低濃度不低于25ng/µl； 
3) 樣品總量：每個(gè)片段總量不少于500ng； 
4) 樣品溶劑：溶于純水或TE中； 
5) 樣品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸（-20℃）；且在運(yùn)輸過(guò)程中請(qǐng)用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

 基因組DNA首先經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理，序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）而甲基化的胞嘧啶保持不變。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化完成后，根據(jù)研究目的的不同可以選擇不同的DNA 甲基化檢測(cè)方法，明確是研究整體水平的甲基化還是特定位點(diǎn)的甲基化，或是要發(fā)現(xiàn)全基因組中新的甲基化位點(diǎn)，根據(jù)客觀條件篩選最靈敏、可靠、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的方法進(jìn)行分析。

    Pyrosequencing技術(shù)（圖2-38）通過(guò)檢測(cè)CpG對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上C/T滲入的比例對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度進(jìn)行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。該技術(shù)通過(guò)將鏈合成過(guò)程中釋放出的焦磷酸（PPi（轉(zhuǎn)化成光信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)鏈的合成過(guò)程。測(cè)序引物可與PCR擴(kuò)增的單鏈DNA模板雜交，與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶等酶以及底物，包括腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和熒光素一起孵育。與模板鏈互補(bǔ)的dNTP在DNA聚合酶的催化下結(jié)合到DNA鏈上，每次互補(bǔ)結(jié)合都會(huì)釋放與dNTP摩爾量相當(dāng)?shù)慕沽姿幔≒Pi）。存在APS的條件下ATP硫酸化酶將PPi轉(zhuǎn)化為ATP，ATP可驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素氧化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光。熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的可見光可用電荷耦合器檢測(cè)，可在原始數(shù)據(jù)輸出中看到一個(gè)峰值（Pyrogram）。每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與結(jié)合的核苷酸量成正比。三磷酸腺苷雙磷酸酶是一種核苷酸降解酶，可連續(xù)降解未結(jié)合的核苷酸與ATP。降解完成之后，結(jié)合另一個(gè)核苷酸。dNTP是依次添加的，反應(yīng)時(shí)Alfa-硫代三磷酸脫氧腺苷（dATPS）是dATP的替代物，因?yàn)镈NA聚合酶對(duì)dATPS的催化效率比對(duì)dATP的催化效率高，且dATPS不是熒光素酶的底物。當(dāng)反應(yīng)繼續(xù)時(shí)，形成互補(bǔ)的DNA鏈，核苷酸序列由Pyrogram的信號(hào)峰值確定。