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全外顯子測序 （Whole-exome sequencing，WES）是高頻應用基因組測序方法。外顯子是人基因組的蛋白編碼區(qū)域，利用序列捕獲技術可以將其DNA捕獲并且富集。
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技術優(yōu)勢
- 直接對蛋白編碼序列進行測序，找出影響蛋白結構的變異
- 高深度測序，可發(fā)現變異頻率低于1%的罕見變異
- 僅針對外顯子組區(qū)域，有效降低測序費用、存儲空間和工作量
產品應用
相比于全基因組測序，外顯子區(qū)域占比小（約1%），因此更容易做到更高深度測序，檢測到更多低頻和罕見變異，同時也能降低測序費用和存儲空間。外顯子測序，50M的捕獲區(qū)域，測序數據量10-12Gb就可以得到100X的有效測序深度。這個特性決定了外顯子測序在遺傳性疾病和腫瘤研究中的重要作用，特別是做腫瘤異質性研究。由于腫瘤異質性，腫瘤內部有很多亞克隆，有些亞克隆的占比很低，應用外顯子高深度測序可以更快、更經濟地檢測出普通測序深度難以發(fā)現的體細胞突變。
圖1 外顯子測序產品應用
華大基因采用Agilent等液相捕獲系統(tǒng)，對人的全外顯子組區(qū)域的DNA進行高效捕獲富集，然后提供基于DNBSEQTM測序技術的捕獲測序服務。建庫和雜交實驗采用官方指定試劑盒，嚴格使用說明書推薦的試劑和耗材，并參照經過優(yōu)化的實驗流程進行操作。如下為DNBSEQTM外顯子測序技術流程。
圖2 DNBSEQTM平臺外顯子建庫流程
測序原理DNBSEQTM平臺外顯子測序產品 ，采用先進的聯合探針錨定聚合技術（cPAS）和改進的DNA納米球（DNB）核心測序技術，提供一站式、開放性的基因測序全面解決方案，具備精準、簡易、快速、靈活、可拓展等優(yōu)點，既能充分適用臨床檢測，也能滿足更廣泛的科研需求。該測序平臺產品的外顯子數據均一性好、單個堿基質量值高。該平臺有五大關鍵的技術：DNB、Pattern array、cPAS、MDA-PE、sCMOS，保證了該平臺測序的準確性。
圖3 DNBSEQTM平臺優(yōu)勢
首先，單鏈環(huán)狀 DNA 分子通過滾環(huán)復制，線性擴增2-3個數量級，增強信號。所產生的擴增產物稱為DNA納米球（DNA nanoball, DNB），采用高密度DNA納米芯片技術，將得到的DNBs加到芯片上的網狀小孔內（固定在陣列化的硅芯片上）。通過聯合探針錨定聚合技術（cPAS）和多重置換擴增的雙末端測序法（MDA-PE）得到讀長為100bp/150bp的雙末端序列。
圖4 DNA 納米球示意圖
MDA-PE的具體原理是：完成第一鏈（Forward Strand）測序后，在具備鏈置換功能的高保真聚合酶的作用下，合成第二鏈（Reverse Strand），并通過DNA分子錨，進行第二鏈的測序。MDA-PE法具有合成快、準確度高等優(yōu)點。與其他二代測序技術相比較，DNB測序技術具有以下幾個優(yōu)勢：
- DNB通過增加待測DNA的拷貝數而增強了信號強度，從而提高測序準確度。
- 不同于PCR指數擴增，滾環(huán)擴增技術的擴增錯誤不會累積。
- DNB與芯片上的網狀小孔大小相同，每個小孔只固定一個DNB，保證信號點之間不產生相互干擾。
- 陣列化測序芯片和DNB測序技術的結合，使得成像系統(tǒng)像素和測序芯片的面積得到充分利用。
信息分析
信息分析從測序的下機數據（raw data）開始，原始下機數據過濾掉接頭、低質量堿基、未測出的堿基（以 N 表示）后比對到參考基因組上，進行SNP檢測和InDel或者CNV分析，然后通過數據庫注釋，對變異檢測的結果通過基于變異有害性、樣本情況和基因功能表型三種分析策略，篩選出于疾病相關的有害性位點或基因。另外, 為了保證高質量的測序數據，在整個分析流程中設置了嚴格的數據質控體系（QC）。
外顯子測序主要適用于腫瘤易感性、致病機理、癌癥異質性、轉移和復發(fā)以及藥物療效研究。其中癌癥異質性需要高深度測序，建議200X以上有效深度，FFPE樣品建議200-300X對應的數據量，需要盡量全面、準確地檢測腫瘤組織發(fā)生的所有突變信息，所以測序深度需要盡可能高，以檢測低豐度突變位點。ctDNA建議500X及以上有效測序深度，用于檢測Somatic 突變以及頻率來判斷ctDNA的存在和水平，從而反應腫瘤負荷等信息。
圖6 腫瘤信息分析內容
產品優(yōu)勢
- 捕獲平臺：Agilent v6芯片和IDT等多種探針選擇
- 測序平臺：單鏈滾環(huán)復制，更少PCR擴增錯誤引入
- 質量卓越：DNBSEQ的變異檢測一致性高，對InDel檢測靈敏度更高，更適合高深度的腫瘤研究
- 項目經驗：發(fā)表國內第一篇外顯子測序文章，項目經驗10年＋，平臺穩(wěn)定
- 廣泛合作：大學、醫(yī)院、科研院所、制藥公司合作超過6000次，樣品總數16萬+
參考文獻
1. Ng SB1, Turner EH., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature.461(7261):272-6.
2. Choi M1,Scholl UI., et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing.Proc Natl Acad Sci USA. 106(45):19096-101.
