酶標(biāo)儀助力偽病毒研究

酶標(biāo)儀可以做啥？

ELISA，核酸蛋白定量，抗原抗體分析，酶動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞活性分析，分子間相互作用， 內(nèi)毒素檢測(cè)……

今天要給大家分享的是酶標(biāo)儀用于Pseudovirus entry assays偽病毒進(jìn)入分析。

最近Alexandra C. Walls等¹在Cell發(fā)表了一篇文章。文章表明SARS-CoV-2作為一種新近出現(xiàn)的病原體，與人ACE2具有高親和力，并將其作為入侵靶細(xì)胞的受體。同時(shí)證明了SARS-CoV S鼠多克隆抗體有效地抑制了SARS-CoV-2 S介導(dǎo)的進(jìn)入細(xì)胞，這表明接種疫苗后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生靶向中性S抗原決定簇的交叉中和抗體。為疫苗和治療劑的設(shè)計(jì)提供了藍(lán)圖。
 

 

Pseudovirus entry assays偽病毒進(jìn)入分析實(shí)驗(yàn)流程如下：
 

在10％FBS，1％PenStrep DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)VeroE6和BHK細(xì)胞。將BHK或VeroE6細(xì)胞以0.3×106的密度接種到12孔板中培養(yǎng)16小時(shí)。部分BHK細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，另一部分BHK細(xì)胞采用lipofectamine 2000（ThermoFisher）的標(biāo)準(zhǔn)方案，每孔用0.8μg ACE2轉(zhuǎn)染，再孵育16小時(shí)。用DMEM洗滌3次后，向孔中加入20uL濃縮的假病毒。2-3小時(shí)后，將含有20％FBS和2％PenStrep的DMEM加入細(xì)胞中培養(yǎng)48小時(shí)。感染48小時(shí)后，將One-Glo-EX以相同的培養(yǎng)體積添加到細(xì)胞中，并在黑暗中孵育10分鐘，然后在Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（ThermoFisher）上進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。對(duì)于進(jìn)入抑制分析，在室溫下將1：100稀釋的血漿與等量的假病毒孵育30分鐘，然后添加標(biāo)準(zhǔn)化量的假病毒到細(xì)胞中感染細(xì)胞。一式三份進(jìn)行測(cè)量，并繪制相對(duì)熒光素酶信號(hào)（RLU）圖形。

圖1. ACE2是SARS-CoV-2 S的功能性受體

（A）用SARS-CoV-2 S，SARS-CoV S和SARS-CoV-2 Sfur / mut假型的MLV的進(jìn)入VeroE6細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值±三次技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

（B）用SARS-CoV-2S或SARS-CoV-2Sfur / mut假型的MLV進(jìn)入hACE2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞中。用兩種獨(dú)立的假病毒制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并顯示了其代表性實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示為平均值±三次技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

 

結(jié)果表明
 

研究使用鼠白血病病毒（MLV）假分型系統(tǒng)S介導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞的功能決定因素（Millet and Whittaker，2016）。為了評(píng)估SARS-CoV-2 S促進(jìn)進(jìn)入靶細(xì)胞的能力，研究者首先比較了SARS-CoV-2 S-MLV和SARS-CoV S-MLV向VeroE6細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，已知這些細(xì)胞表達(dá)ACE2和支持 SARS-CoV復(fù)制（Drosten et al., 2003; Ksiazek et al., 2003）。兩種假病毒均能很好地進(jìn)入細(xì)胞（圖1A），這表明SARS-CoV-2 S-MLV可以使用非洲綠猴ACE2作為進(jìn)入受體。為了證實(shí)這些結(jié)果，研究者評(píng)估了進(jìn)入BHK細(xì)胞的過(guò)程，并觀察到hACE2的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使其易于被SARS-CoV-2 S-MLV轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖1B）。這些結(jié)果表明，hACE2是SARS-CoV-2的功能性受體，與最近報(bào)道的發(fā)現(xiàn)一致（Hoffmann et al., 2020; Letko et al., 2020; Zhou et al., 2020）。
 

另一篇是Young-Jun Park等²發(fā)表在Nature Structural & Molecular Biology上的文章。中東呼吸綜合癥冠狀病毒（MERS-CoV）會(huì)導(dǎo)致人類嚴(yán)重的甚至致命的呼吸道疾病，因此沒(méi)有疫苗或特定的治療方法。研究表明通過(guò)識(shí)別一個(gè)保守的溝槽，該溝槽對(duì)于MERS-CoV S介導(dǎo)的唾液酸化物進(jìn)入人體氣道上皮細(xì)胞至關(guān)重要。其數(shù)據(jù)闡明了MERS-CoV S唾液苷的特異性，并表明與α2,6-連接的受體相比，對(duì)α2,3-連接的選擇性是與前一類寡糖相互作用增強(qiáng)的結(jié)果。本研究提供了一個(gè)結(jié)構(gòu)框架，說(shuō)明MERS-CoV附著于唾液酸苷受體，并識(shí)別抑制病毒進(jìn)入的潛在脆弱性位點(diǎn)。

 

Pseudovirus entry assays偽病毒進(jìn)入分析實(shí)驗(yàn)流程如下：
 

制備MERS-CoV S假型的鼠白血病病毒。使用Lipofectamine 2000或3000轉(zhuǎn)染試劑按照制造商的說(shuō)明使用（ThermoFisher），將HEK293T / 17細(xì)胞與全長(zhǎng)MERS-CoV S或MERS-CoV S突變體編碼質(zhì)粒，鼠白血病病毒Gag-Pol包裝構(gòu)建體以及編碼熒光素酶報(bào)告基因的鼠白血病病毒轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染。用轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基將細(xì)胞在37°C和8％CO2下孵育5–12小時(shí)。然后將細(xì)胞用DMEM洗滌兩次，并加入含有10％（vol / vol）FBS的DMEM培養(yǎng)達(dá)72小時(shí)。然后收集上清液，并通過(guò)0.45μm膜過(guò)濾，然后用30 kDa離心濃縮器膜（Amicon）濃縮。

 

胰蛋白酶消化后，將含有10％（vol / vol）FBS和1％（vol / vol）PenStrep的DMEM中生長(zhǎng)的Calu-3細(xì)胞以每毫升〜3.2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中，使其生長(zhǎng)。在37°C下以8％（vol / vol）的CO2進(jìn)行48小時(shí)。將細(xì)胞用DMEM洗滌3次，添加40μl MERS-CoV S或MERS-CoV S突變型假病毒于37°C，8％（vol / vol）CO2的條件下培養(yǎng)2h。溫育2小時(shí)后，將40μl的20％（vol / vol）FBS和2％（vol / vol）PenStrep加入孔中，并將板溫育72小時(shí)。以等體積添加ONE-Glo-EX（約75μl，以解決蒸發(fā)），并在Varioskan多功能酶標(biāo)儀上讀取熒光素酶信號(hào)數(shù)值。

b，MERS-CoV S F39A，H91A，S133A或R307A突變抑制了假型鼠白血病病毒顆粒進(jìn)入人氣道Calu-3細(xì)胞。相對(duì)于野生型將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并顯示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。n = 3個(gè)偽病毒實(shí)驗(yàn)（技術(shù)重復(fù)）。

Extended Data 5 | SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析。

b，使用抗MERS-CoV S1多克隆抗體對(duì)用野生型或突變體MERS-CoV S假型化的鼠白血病病毒顆粒進(jìn)行Western印跡分析。未裁剪的污點(diǎn)圖像可用作源數(shù)據(jù)。

 

結(jié)果表明
 

由于分別破壞涉及Neu5Ac C1羧酸鹽和甘油側(cè)鏈的上述靜電相互作用，S133A和R307A突變體消除了假型病毒顆粒的進(jìn)入（圖3b和Extended Data圖5b）。F39A和H91A突變體顯示假型顆粒的傳染性降低了90％以上，這可能是由于配體結(jié)合凹槽的破壞和有利的范德華力或靜電相互作用的喪失（圖3b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5b）。

 

Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀

 

 

應(yīng)用領(lǐng)域

傳染病，毒理學(xué)，免疫學(xué)，神經(jīng)生物學(xué)，癌癥研究，基因編輯，干細(xì)胞生物學(xué)等

 

對(duì)研究人員/臨床研究實(shí)驗(yàn)室的好處

● 研究藥物，病毒制劑和其他探針對(duì)細(xì)胞，蛋白質(zhì)檢測(cè)和定量的影響

● 準(zhǔn)確的NA定量

● 快速分析大量樣品

● 完全自動(dòng)化兼容

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