整體透明光片三維成像技術(shù)在骨與牙組織神經(jīng)投射研究的應(yīng)用

骨和牙組織一直以來都是醫(yī)學和生物學研究的重點領(lǐng)域。從功能上看，它們承擔著不可或缺的角色。骨骼為身體提供支撐框架，保障我們能夠站立、行走和進行各種活動；牙齒則負責咀嚼食物，開啟消化過程的第一步。長期以來，科學家們已經(jīng)認識到感覺和交感神經(jīng)元對骨和牙組織有著緊密的神經(jīng)支配關(guān)系。例如，在疼痛感知方面，當我們的牙齒出現(xiàn)齲齒或骨骼受到損傷時，會產(chǎn)生疼痛信號，這背后就離不開神經(jīng)的傳導。在骨穩(wěn)態(tài)的維持上，神經(jīng)也發(fā)揮著微妙的調(diào)節(jié)作用，它們就像幕后的“指揮官”，協(xié)調(diào)著骨細胞的活動，確保骨骼的正常代謝和修復。

過往的研究主要依賴傳統(tǒng)的組織學分析方法，也就是對薄切片進行研究。這種方法雖然在一定程度上為我們提供了有價值的數(shù)據(jù)，但存在著明顯的局限性。當試圖從多個薄切片重建三維圖像時，由于在切片過程中重要結(jié)構(gòu)信息的丟失或扭曲，我們很難全面、準確地觀察和分析分散的神經(jīng)元投射情況。而且，三維重建過程復雜、耗時，還容易因為切片間染色的差異和人為因素引入誤差，就像拼圖時部分拼圖塊缺失或錯誤，難以還原完整的圖像。

隨著科技的飛速發(fā)展，組織透明技術(shù)和光片三維成像技術(shù)應(yīng)運而生，為這一研究領(lǐng)域帶來了新的曙光。這些先進技術(shù)使得在完整組織中以細胞分辨率對神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進行三維可視化研究成為可能。

研究方法精要
1、組織取材和脫鈣
研究選取小鼠其股骨和下頜骨進行實驗。首先是組織取材與固定，小鼠經(jīng)麻醉后，通過左心室灌注特定溶液，取出股骨和下頜骨，仔細清理周圍軟組織，并在特定條件下進行固定。接著是關(guān)鍵的脫鈣環(huán)節(jié)，在室溫下進行30-40小時的脫鈣處理，同時不斷旋轉(zhuǎn)樣本，確保脫鈣效果均勻。

2、組織脫色、染色和透明
脫鈣完成后進行脫色、免疫染色等操作，其中免疫染色使用了抗體，每種抗體的稀釋比例和孵育條件都經(jīng)過了精心優(yōu)化。最后進行組織透明化處理，通過一系列試劑的梯度浸泡和孵育，使組織達到透明狀態(tài)，便于后續(xù)成像觀察。

3、圖像處理
在成像方面，綜合運用立體顯微鏡和光片熒光顯微鏡，針對不同的樣本和觀察需求，選擇合適的物鏡和成像參數(shù)，確保能夠獲取高質(zhì)量的圖像。隨后利用專業(yè)軟件對圖像進行處理和分析，包括圖像預(yù)處理、拼接和三維可視化和神經(jīng)元分割等操作，從而清晰地呈現(xiàn)神經(jīng)末梢在骨和牙組織中的空間三維分布情況。

實驗結(jié)果亮點
1、股骨神經(jīng)纖維分布
在股骨的研究中，發(fā)現(xiàn)GP9.5標記的神經(jīng)束有著獨特的分布路徑。它們通過股骨近端干骺端和遠端骨骺的滋養(yǎng)孔進入骨髓腔，進入后像樹枝一樣廣泛分支。在近端進入的神經(jīng)束，一部分分支延伸到轉(zhuǎn)子和股骨頸上方，另一部分則向下進入骨干骨髓腔，這些分支在骨干內(nèi)常常平行排列，且延伸距離較長，但不會跨越生長板。在遠端骨骺進入的神經(jīng)束則終止于軟骨下骨的骨髓腔。

神經(jīng)纖維與血管的關(guān)系也十分密切。在骨髓腔中，常�？梢杂^察到神經(jīng)纖維沿著血管走行，其末端形態(tài)多樣。有的呈經(jīng)典的螺旋狀圍繞血管，有的則以游離末端的形式終止在血管附近或遠離血管的地方。其中一些游離末端在其長度方向上存在膨體結(jié)構(gòu)，而另一些則沒有，并且多數(shù)游離末端呈球狀。從股骨近端到遠端，神經(jīng)支配密度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，在骨干的下三分之一和遠端干骺端密度最低。

CGRP標記的軸突同樣經(jīng)股骨近端頸部或遠端骨骺的滋養(yǎng)孔進入骨髓腔，進入后沿著骨干平行向下延伸，標記不同之處在于纖維，它們沒有螺旋狀形態(tài)，而是在長度方向上有大量的膨體結(jié)構(gòu)，且大多以游離末端的形式終止在骨髓腔或靠近骨內(nèi)膜處。部分軸突還會沿著血管從骨髓腔進入皮質(zhì)骨，或者從皮質(zhì)骨進入骨髓腔。在骨干的下三分之一區(qū)域，偶爾會出現(xiàn)非常復雜的終止結(jié)構(gòu)，通過對其進行細絲追蹤發(fā)現(xiàn)，這些復雜結(jié)構(gòu)的軸突長度可達約7659μm，具有102個分支點和65個末端。

TH標記的神經(jīng)纖維在股骨中的分布也有其特點。與CGRP標記的感覺神經(jīng)纖維不同，它在血管周圍呈現(xiàn)明顯的螺旋狀形態(tài)，且只有較少的軸突分支終止在骨髓腔或骨內(nèi)膜附近。在遠端骨骺的軟骨下骨區(qū)域，有大量的TH標記神經(jīng)纖維和末端。這些神經(jīng)纖維會穿過皮質(zhì)骨的管道，跟隨血管在骨髓腔和皮質(zhì)骨之間穿梭。在骨干的下三分之一處，還能觀察到TH標記神經(jīng)纖維與血管之間復雜的分支關(guān)系，有時會出現(xiàn)單個軸突分支并環(huán)繞兩三個相鄰血管的情況，其末端緊密貼近血管。

2、下頜骨及牙髓神經(jīng)纖維分布
對于下頜骨及牙髓的神經(jīng)支配研究也有重要發(fā)現(xiàn)。PGP9.5標記的神經(jīng)纖維支配下頜磨牙，它們從下牙槽神經(jīng)發(fā)出，呈束狀走行，在接近磨牙及其周圍組織時逐漸分支變細。這些分支通過磨牙根的根尖孔進入牙髓，進入后向冠髓投射并廣泛分支，形成密集的神經(jīng)叢。此外，還有一束神經(jīng)纖維通過牙根的副根管進入牙髓，這一發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)進入牙髓的途徑提供了新的認識。在磨牙周圍的組織中，如牙槽骨、牙周韌帶和牙齦等部位，也有神經(jīng)纖維的分布。一些小分支在牙槽骨中終止，部分分支進入牙周韌帶和牙齦，其末端形態(tài)多樣，包括游離末端和其他的復雜末端，并且在牙周韌帶中形成圍繞牙根的“籃子”狀結(jié)構(gòu)。

CGRP標記的神經(jīng)纖維在牙髓及周圍組織中廣泛分布，同樣通過根尖孔和副根管進入牙髓，在牙髓內(nèi)形成極為密集的神經(jīng)支配網(wǎng)絡(luò)。在牙周韌帶、下頜牙槽骨（包括骨髓）和牙齦等部位，也有大量的CGRP標記軸突分支，且大多以游離神經(jīng)末端的形式終止。通過高分辨率成像可以清晰地分辨出這些軸突在牙周韌帶中的終止結(jié)構(gòu)，它們參與構(gòu)成了圍繞磨牙的“籃子”狀結(jié)構(gòu)，為牙周組織的神經(jīng)支配提供了更詳細的信息。

TH標記的神經(jīng)纖維在牙髓中也有較多分布，同樣通過根尖孔和副根管進入，但通過副根管進入的數(shù)量相對較少。在周圍組織中，TH標記的神經(jīng)纖維主要圍繞血管分布，在牙周韌帶、下頜牙槽骨和牙齦等部位的分布相對稀疏，只有少數(shù)軸突以游離末端的形式終止在血管外，且不參與牙周組織中“籃子”狀結(jié)構(gòu)的形成。

未來研究展望
這一創(chuàng)新技術(shù)通過獨特的雙焦點成像方案和深度學習分類網(wǎng)絡(luò),顯著提升了大組織成像的速度和效率。在多種樣本成像實驗中，SIFT均表現(xiàn)出卓越的性能，無論是小鼠前爪、胃，還是斑馬魚幼蟲、小鼠結(jié)腸和大腦等組織，SIFT都能以更快的速度獲取高質(zhì)量的圖像。其在空間分辨率和時間分辨率方面的優(yōu)勢，使得研究人員能夠更清晰地觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)，更及時地捕捉動態(tài)變化。

SIFT對不同組織透明化方法適應(yīng)性強，在生物醫(yī)學成像領(lǐng)域應(yīng)用潛力大。雖目前成像速度受相機等限制，但為ASLM技術(shù)發(fā)展提供重要思路。未來，靠改進相機、采用更快LFA或優(yōu)化控制信號等，有望提升其性能，為生物醫(yī)學研究開拓更多可能，助力探索生命奧秘、攻克疾病難題。

通過整體透明光片三維成像技術(shù)探究神經(jīng)元亞群與骨、牙組織細胞之間的神經(jīng)信號傳導通路，是理解神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。整體透明光片三維成像技術(shù)結(jié)合基因編輯、蛋白質(zhì)組學、空間組學和MERFISH等先進技術(shù)，我們能深入研究神經(jīng)元與骨細胞、成牙本質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞等之間的分子機制，為我們理解疾病的發(fā)病機制提供新的視角，為早期診斷和治療找到潛在的生物標志物和靶點。

聲明：本文僅用作學術(shù)目的。文章來源于：Thai J, Fuller-Jackson JP, Ivanusic JJ. Using tissue clearing and light sheet fluorescence microscopy for the three-dimensional analysis of sensory and sympathetic nerve endings that innervate bone and dental tissue of mice. J Comp Neurol. 2024 Jan;532(1):e25582. doi: 10.1002/cne.25582.