磁性瓊脂糖在蛋白質(zhì)純化中的優(yōu)勢(shì)

目前大多數(shù)蛋白質(zhì)純化方法都使用帶有親和功能的瓊脂糖珠，例如IM谷胱甘肽或抗體。這些官能團(tuán)的選擇取決于要純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)，并且種類繁多，包括可以與生物分子偶聯(lián)的預(yù)官能化磁珠（請(qǐng)參閱蛋白質(zhì)純化電子書(shū)第4和5章）。

瓊脂糖常用作蛋白質(zhì)純化的基質(zhì)，其原因有兩個(gè)。首先，瓊脂糖顯示出與蛋白質(zhì)非常低的非特異性結(jié)合，從而提高了洗脫的蛋白質(zhì)組分的純度。其次，瓊脂糖顆粒整體上由親水的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，其大小足以使蛋白質(zhì)擴(kuò)散。該網(wǎng)孔首先使生物分子能夠與瓊脂糖顆粒的外殼相互作用，從而在官能團(tuán)和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間提供較大的相互作用比表面，并提高在蛋白質(zhì)純化中可獲得的產(chǎn)量。

瓊脂糖基質(zhì)既可以是非磁性的，也可以是利用磁鐵礦（Fe3O4）核來(lái)使其具有磁性的。非磁性瓊脂糖微球通常比磁性微球大（直徑40-150μm），以降低色譜中的背壓。磁珠通常較小（直徑為2-40微米）。較小的微球可提供更多的表面積，因此與目的蛋白質(zhì)有更強(qiáng)的相互作用。然而，為了獲得最佳磁性，應(yīng)使用的最小尺寸為10μm的磁珠，特別是在使用亞鐵磁珠時(shí)（見(jiàn)SEPMAG®蛋白質(zhì)純化電子書(shū)第12章）。

為了獲得最大的靈活性、磁性和非磁性材料之間的親和功能以及表面化學(xué)性質(zhì)應(yīng)相同，以便在兩個(gè)系統(tǒng)之間輕松切換。

 非磁性和磁性瓊脂糖珠之間的主要區(qū)別是它們與周圍介質(zhì)的分離方式。在第一個(gè)純化步驟中，該培養(yǎng)基可以是細(xì)菌或細(xì)胞裂解液，細(xì)胞培養(yǎng)基或任何種類的生理緩沖液。在蛋白質(zhì)純化的洗滌和洗脫步驟中，該培養(yǎng)基包含了具有不同特性（例如鹽濃度、pH）的緩沖液，這些緩沖液會(huì)誘導(dǎo)特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，污染物的去除和目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫。這些溶液的粘度也可以變化，例如當(dāng)添加甘油等物質(zhì)以減少非特異性結(jié)合時(shí)。每個(gè)蛋白質(zhì)純化過(guò)程都需要幾個(gè)分離步驟，因此有效的分離對(duì)處理時(shí)間和純化的成功都有很大影響。

對(duì)于所有蛋白純化實(shí)驗(yàn)，重要的是將親和微球的量調(diào)整至與起始材料中蛋白的量相匹配。這不僅因?yàn)槌杀驹�因很重要：親和力基質(zhì)太少會(huì)導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)的不完全結(jié)合。另一方面，過(guò)多的親和力結(jié)合位點(diǎn)將導(dǎo)致其他蛋白的結(jié)合，從而使純化的特異性降低，因此就需要額外的純化步驟才能獲得較純的蛋白。

非磁性瓊脂糖珠可以通過(guò)離心，在重力柱中或在色譜系統(tǒng)上通過(guò)過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。在這些方法之間切換（例如當(dāng)使用更高的純化規(guī)模時(shí)）需要進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)水平低時(shí)，需要將大量的起始材料應(yīng)用于相當(dāng)少量的瓊脂糖微球，這可能是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程。對(duì)于僅需要微升體積且非常敏感的應(yīng)用（例如免疫沉淀），分離可能會(huì)不完全，從而導(dǎo)致材料損失或瓊脂糖微球污染。

圖 2. IDA 與 NTA 螯合配體次氮基三乙酸（NTA）和亞氨基二乙酸（IDA）提供多聚組氨酸標(biāo)簽的 Ni² +  和咪唑環(huán)之間的相似相互作用，但 NTA 使 Ni² + 具有 4 個(gè)價(jià)態(tài)而IDA 僅具有 3 個(gè)（橙色圓圈）。這種差異會(huì)影響所得純化蛋白級(jí)分的質(zhì)量。

對(duì)于磁珠，無(wú)論應(yīng)用和體積如何，分離原理都是一樣的。測(cè)試反應(yīng)或免疫沉淀等敏感應(yīng)用可以在幾微升內(nèi)完成，甚至可以在微升機(jī)器人上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。從數(shù)升培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解液中純化蛋白質(zhì)同樣可以做得很好，因?yàn)樵诘谝徊椒蛛x后處理量顯著減少。