利用熒光法檢測蛋白濃度的兩種方式
蛋白質(zhì)定量是許多蛋白質(zhì)生物學工作流程的重要組成部分，是蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜和免疫分析等常用技術(shù)之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比，熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準確性更高。
蛋白質(zhì)定量是許多蛋白質(zhì)生物學工作流程的重要組成部分，是蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜和免疫分析等常用技術(shù)之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比，熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準確性更高。
試劑及儀器
• Qubit™ Protein Assay Kits（Thermo：Q33212）
• Qubit 4熒光計（Thermo）
• Fluo-200熒光計（奧盛）
• Feyond-A300多功能酶標儀（奧盛）
方法
• 標品配置
| 加樣體積 | 10μL |
| 標品配制 | 將試劑盒中最高濃度的400ng/uL蛋白標品稀釋配制成300、200、100、50、25、12.5ng/uL共6個濃度，試劑盒濃度范圍在12.5 µg/mL 到 5 mg/mL。 |
• 操作步驟
1.根據(jù)試劑說明書，制備染料Mix工作液及0、200及400ng/uL校準點試劑，校準曲線完成后，分別在Qubit4與Fluo-200上進行檢測；
表1 Feyond-A300參數(shù)
| 試劑波長 | EX/EM：470/525 |
| PMT增益 | 中低 |
| 穩(wěn)定時間 | 150ms |
| 積分時間 | 40μs |
圖1. 樣品布局界面
結(jié)果
1.利用Feyond-A300的內(nèi)置數(shù)據(jù)處理軟件，將蛋白標品濃度與熒光強度進行標準曲線擬合，采用四參數(shù)（4PL）擬合方式，得到曲線方程與曲線擬合度，R2接近為1（圖2）。
圖2. 蛋白標準曲
2.濃度范圍在12.5 ng/uL~400ng/uL時，F(xiàn)luo-200與Qubit4的檢測濃度偏差均在10%以內(nèi)，是Qubit的合理偏差。除接近極限濃度的最低點外，F(xiàn)eyond-A300的檢測濃度與Qubit4相比也在合理偏差內(nèi)，且與理論濃度更為接近（表2）。
表2 三款儀器的檢測數(shù)據(jù)
| 理論濃度 | Qubit4 | Fluo-200 | Feyond-A300 |
| 12.5 | 20 | 19.11 | 8.023 |
| 25 | 33.2 | 30.59 | 29.319 |
| 50 | 50.6 | 46.16 | 50.626 |
| 100 | 95.2 | 92.94 | 101.835 |
| 200 | 184 | 192.39 | 197.206 |
| 300 | 286 | 299.71 | 302.978 |
| 400 | 400 | 401.22 | 398.596 |
總結(jié)
Qubit 熒光檢測蛋白試劑盒，不僅在Qubit儀器上可以適用，也可在Feyond-A300的熒光檢測功能上適用，并且準確性基本無差異，熒光計檢測無需建立標準曲線，僅需進行標品點的校準，便可直接進行濃度的測試，簡單便捷。Feyond-A300的標曲保存功能，亦可滿足該需求，僅需一次建立標曲后，將標曲保存于標曲庫，后續(xù)僅需調(diào)取該標曲便可直接給出未知樣品的濃度。
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