多熒光成像技術(shù)助力蛋白質(zhì)結(jié)晶的靈敏檢測(cè)

研究問(wèn)題：

生物晶體的明確和可靠鑒定仍然是晶體學(xué)研究的主要障礙，尤其是在初始篩選實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵階段。而在可見(jiàn)光范圍內(nèi)以高分辨率自動(dòng)成像通常不足以識(shí)別能夠或可能形成晶體的所有條件。

微量熒光標(biāo)記

內(nèi)在熒光主要取決于天然存在的色氨酸的量，而一種可能克服內(nèi)在熒光缺點(diǎn)的辦法是微量熒光標(biāo)記 (TFL)。已確定的實(shí)驗(yàn)方案包括在結(jié)晶前立即用各種熒光染料快速標(biāo)記 0.1% 的樣品。多重標(biāo)記除了與固有熒光相比顯著增強(qiáng)的信噪比外，還可用于驗(yàn)證晶體中多亞基復(fù)合物的存在。

使用 MFI 對(duì)晶體進(jìn)行靈敏檢測(cè)

紫外光和 TFL 成像成為了晶體檢測(cè)的替代工具。

多熒光成像 (MFI) 提供了可供用戶選擇的 3 種不同波長(zhǎng)下成像的靈活性，包括紫外和可見(jiàn)熒光，以輕松檢測(cè)蛋白質(zhì)晶體，即使是那些掩埋在沉淀下的晶體。

紫外光通過(guò)紫外成像照射蛋白液滴，由芳香族氨基酸（如色氨酸）產(chǎn)生的熒光被檢測(cè)到以創(chuàng)建圖像。通過(guò)僅用熒光團(tuán)標(biāo)記 0.1% 的樣品，TFL 還能夠檢測(cè)幾乎不含色氨酸的蛋白質(zhì)。

發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物

借助多熒光成像 (MFI)，用戶現(xiàn)在可以區(qū)分蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體和單一蛋白質(zhì)的晶體。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，先用兩種不同的胺活性染料標(biāo)記兩種可疑的蛋白質(zhì)或亞基，然后在兩個(gè)相應(yīng)的波長(zhǎng)下對(duì)液滴進(jìn)行成像。在兩種波長(zhǎng)上都發(fā)出熒光的晶體是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，而那些只在一種波長(zhǎng)上發(fā)出熒光的晶體是單一蛋白質(zhì)。

大范圍的放大倍率

借助 3 個(gè)物鏡，用戶可以縮小以查看整個(gè)液滴或放大以更詳細(xì)地查看晶體。9MP 圖像的數(shù)字縮放能讓用戶將 FOV 直接與可見(jiàn)圖像匹配。

3 種不同的波長(zhǎng)下的成像

用戶可以選擇多達(dá) 3 種不同的光波長(zhǎng)來(lái)對(duì)晶體進(jìn)行成像，包括紫外線和各種可見(jiàn)光波長(zhǎng)�？苫�換的濾光片模塊能夠最大限度地提高圖像質(zhì)量和染料標(biāo)簽的兼容性。

一次最多可以安裝三個(gè)過(guò)濾器模塊，并且可以輕松切換。默認(rèn)濾光片配置包括：UV 熒光、熒光素和 Texas 紅濾光片組。

持久的快速和安全標(biāo)記

簡(jiǎn)單的 0.1% 蛋白質(zhì)標(biāo)記方案

1. 制備 5mM 琥珀酰亞胺酯染料在 DMSO 中的儲(chǔ)備溶液。

2. 假設(shè)對(duì)胺殘基的化學(xué)計(jì)量標(biāo)記效率為 1:1，則在蛋白質(zhì)溶液中加入適量的染料，以 0.1% 標(biāo)記賴(lài)氨酸殘基。

3. 等待 5 分鐘，此時(shí) 90% 的染料被結(jié)合。

    

無(wú)需純化，且樣品在 120 天后仍有熒光。已證明用熒光團(tuán)標(biāo)記蛋白質(zhì)對(duì)結(jié)晶沒(méi)有已知的負(fù)面影響，并且其被證明是一種有效識(shí)別蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法。