MicroRNA(miRNA)熒光定量PCR

一、什么是miRNA?
MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測(cè)，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機(jī)制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRN As 。

二、miRNA是如何產(chǎn)生的？

miRNAs 是轉(zhuǎn)錄后長(zhǎng)片段的 RNA 分子（ pri-miRNA ）的一部分，首先在細(xì)胞核內(nèi)被雙鏈 RNA 特異的核酸酶Drosha 處理成為 70-100 個(gè)核苷酸組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA （ pre-miRNA ）。這一發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA 運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，被另一個(gè)雙鏈 RNA 特異的核酸酶 Dicer 剪切，得到 19-23 個(gè) 核苷酸組成的成熟的 miRNA ，結(jié)合在與 RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（ RISC ）類似或者相同的復(fù)合物中，這個(gè)復(fù)合物參與了 RNA 干擾。由 miRNA 和靶基因 mRNA 的堿基配對(duì)引導(dǎo) RISC 降解目的片段或是阻礙其翻譯過(guò)程。 miRNA 和它的目的 mRNA 互補(bǔ)的堿基配對(duì)決定了這個(gè)過(guò)程的特異性。通過(guò)抑制翻譯還是降解發(fā)揮作用是由 miRNA 和它的目的 mRNA 之間的錯(cuò)配程度決定的，匹配程度高的目的 mRNA 將被降解。由于 miRNAs 可以對(duì)不完全互補(bǔ)的 mRNA 配對(duì)來(lái)抑制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，因而每個(gè) miRNA 可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè) miRNAs 可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè) miRNA 來(lái)經(jīng)濟(jì)地調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè) miRNAs 的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。對(duì)于基于 miRNA 調(diào)控基因表達(dá)的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

三、miRNA熒光定量PCR基本原理
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ弧㈧`敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25個(gè)核苷酸組成的小RNA，長(zhǎng)度太短，并不能通過(guò)傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè),但是通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實(shí)時(shí)定量PCR引物及探針可以精確檢測(cè)微量樣品中microRNA表達(dá)水平，也可以用終點(diǎn)PCR法定性檢測(cè)。

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